一種檢測噻苯咪唑的試劑盒及其檢測方法用于對蘋果中噻苯咪唑含量的檢測。本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被噻苯咪唑抗原，樣本中噻苯咪唑和此抗原競爭抗噻苯咪唑抗體（抗試劑），同時抗噻苯咪唑抗體與酶標二抗（酶標物）相結合，經TMB底物顯色，樣本吸光值與其含有的噻苯咪唑成負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中噻苯咪唑的含量。

技術領域

一種快速高效檢測食品中噻苯咪唑的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法，屬于酶聯免疫分析 (ELISA) 技術領域，主要用于食品中噻苯咪唑殘留的檢測。

背景技術

噻苯咪唑是目前經常使用的防腐保鮮劑，常用于采收前或采收后的果蔬，經噴霧或浸蘸后的果蔬，不但可以延長貯存時間，還可保鮮、保色。這些食品添加劑具有一定的生物毒性效應，殘留量超標將不可避免對人體健康產生影響。我國對這些殺菌劑有明確的殘留限量要求團，國家質檢總局發布公告，禁止對輕基苯甲酸丙醋等33種產品作為食品添加劑生產、銷售和使用，省質監局已停止受理其生產許可申請閉，其中包含噻苯咪唑。

目前，國內外報道的果蔬殘留防腐劑的檢測方法主要涉及有分光光度法、膠束電動色譜法困、高相液相色譜法、液相色譜串聯質譜法、氣相色譜串聯質譜法等，在各種檢測方法的建立，樣品前處理是不可缺少的前提條件，尤其是針對痕量分析時，樣品前處理是影響分析結果的關鍵環節，常引起樣品檢測誤差，限制檢測靈敏度，盡管提取凈化方法有索氏提取、振蕩提取、液一液分配、柱層析等技術，雖然這些技術不需要昂貴的設備和特殊儀器，但卻是整個分析過程中費時費力、易引起誤差的環節；且大量有機溶劑的使用，易造成對環境的污染。因此，需要發明一種工序少、操作簡便檢測的新方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種結構簡單，使用方便，廉價，方便攜帶的檢測噻苯咪唑的試劑盒。

本發明的另一個目的是克服其他方法的一些不足，從而提供一種樣品前處理簡單，提取后就可直接測定，不需要進化過程，一次可測定大量樣本，而且簡便，快速，靈敏，準確，廉價的檢測噻苯咪唑的方法。

本發明試劑盒主要由盒體，酶標板一塊，標準液6瓶（1 mL/瓶）：0ppb； 0.6ppb；1.8ppb；5.4ppb；16.2ppb；48.6ppb，酶標物1瓶（6 mL），顯色液Ａ（6 mL），顯色液Ｂ（6 mL），終止液（6 mL）濃縮洗滌液10×（40mL），濃縮樣品稀釋液5×（20 mL），海綿托架所組成。海綿托架內裝有試劑瓶，海綿托架和酶標板均安裝在盒體內。

本發明主要采用酶聯免疫吸附（ELISA）競爭法來檢測噻苯咪唑。

制備針對噻苯咪唑的單克隆抗體：

1．免疫動物：采用小劑量長周期的免疫方案。對6～8周齡的雌性BALB/c小鼠，體重18～20g，首次免疫用100μg噻苯咪唑-小牛血清白蛋白(BSA)與等量完全福氏佐劑混勻，腹腔注射。2周后，用50μg噻苯咪唑-BSA與等量不完全福氏佐劑混勻后，腹腔注射。此后每隔2周用50μg噻苯咪唑-BSA與等量不完全福氏佐劑混勻，腹腔注射。8周后脾內免疫50μg噻苯咪唑-BSA作為加強免疫，3d后取脾細胞進行融合。

2．細胞融合：免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞（Sp2/0）以10∶1混合，用50%聚乙二醇(PEG)作融合劑。融合細胞懸于含20%小牛血清的選擇培養基內，分種于加有BALB/c小鼠腹腔滲出細胞作滋養層的96孔細胞培養板中，置5%CO₂，37℃孵箱中培養，當鏡檢雜交瘤克隆生長達1/3～1/2視野時，取上清進行篩選。