本發明公開了一種抗綠膿桿菌外毒素A的納米抗體及其應用，所述納米抗體具有獨特的3個互補決定區CDR1、CDR2、CDR3，所述應用為所述納米抗體在制備抗綠膿桿菌外毒素A藥物中的應用。本發明提供的抗綠膿桿菌外毒素A納米抗體對綠膿桿菌外毒素A具有特異的識別和結合能力，并且能夠有效中和綠膿桿菌外毒素A的毒性作用，從而對正常細胞起到保護作用。

技術領域

本發明公開了一種納米抗體，屬于免疫學領域。

背景技術

綠膿桿菌，又稱銅綠假單胞菌(學名Pseudomonasaeruginos′)，是一種革蘭氏陰性菌、好氧、呈長棒形的細菌，只有單向的運動性。綠膿桿菌是1882年首先由Gersard氏從傷口膿液分離得到。該菌在自然界廣泛存在于水、土壤、空氣以及動物的腸道和皮膚中，為一種條件性致病菌，在特定的情況下能引起人及動物感染發病。

1972年，P.v.Liu在臨床分離株的培養液中，發現了導致綠膿桿菌感染的毒性因子——外毒素A，并指出綠膿桿菌外毒素A(Pseuduomonas Exotoxin A，PE)對皮膚黏膜有壞死作用，進入血液中能誘發敗血癥。在臟器組織細胞中，綠膿桿菌外毒素A與白喉毒素類似，具有阻礙蛋白質合成的作用；對小鼠和大鼠感受性高，具有致死作用，對培養細胞有“細胞崩壞毒性”。綠膿桿菌外毒素A的毒性非常強，能夠對機體組織及器官造成極大危害，甚至能夠破壞角膜基質細胞。為了探討有效控制和治療綠膿桿菌外毒素A相關疾病的方法，對綠膿桿菌外毒素A的生物學特性及其致病性的研究也越來越多。

已有的研究成果表明，綠膿桿菌外毒素A是一個66kD的單鏈毒素蛋白，它具有三個結構域，其中Ia區主要負責細胞的識別，使PE與靶細胞結合；Ⅱ區是轉位區，使之能夠進人細胞漿；Ⅲ區是活性區，催化延長因子2(Elongation Factor 2，EF2))ADP核糖基化，導致Ef2失活，阻礙蛋白合成，最終導致細胞死亡；Ib區功能至今不明，但是大部分氨基酸的缺失不影響其毒素分子的活性。PE是目前已知最有效的細胞毒素之一，由于其集細胞結合、轉位及酶活性三種功能于一身，因此比其他毒素更適合于基因改造，從而達到構建重組免疫毒素的要求。經改構的缺失細胞識別區的PE是目前最常用的毒素蛋白之一，其可通過抑制細胞蛋白質合成，發揮損傷和殺死細胞的作用。由于上述特性，將PE與特定的載體結合(如單克隆抗體、細胞因子等)組成相應的免疫毒素，可用于腫瘤的靶向治療研究。

基于PE毒素在臨床病理學所表現出的突出特性以及在臨床治療領域特別是腫瘤治療上作為免疫毒素組成部分所具有的巨大應用前景，研發出針對PE毒素的特異性中和抗體，改善臨床診斷和治療效率成為現有技術的迫切需求。

但是基于傳統抗體的一些缺點，例如親和力不高，免疫識別效率低下，對于一些隱蔽程度較高的抗原和毒素難以達到理想的結合和中和效果。

1993年，Hamers-Casterman等研究發現，在駱駝科動物(駱駝，單峰駱駝和美洲駝)的體內發現了一類僅有重鏈二聚體(H₂)的抗體，其主要是IgG2和IgG3類型，此類抗體由于缺乏輕鏈，于是將這種抗體稱為僅有重鏈的抗體(Heavy chain only like Antibody，HCAbs)，而它們的抗原結合部位由一個結構域組成，稱為VHH區，因此該類抗體也被稱為單結構域抗體或者單域抗體(sdAb)。由于該類抗體為去除恒定區后的可變區序列，分子量只有15kD，大約10納米的直徑，因此也被稱為納米抗體(Nbs)。另外，在鯊魚中也觀察到這類單結構域抗體，稱為VNAR。這種僅有重鏈的抗體原來只是作為一種人類B細胞增生性疾病(重鏈病)的病理形式被人們所認識。這種僅有重鏈的抗體可能是由于基因組水平的突變和缺失而導致重鏈CH1結構域不能表達，使得表達出的重鏈缺乏CH1，從而缺乏與輕鏈的結合能力，因此形成一種重鏈二聚體。

相對于常規的四鏈抗體的scFv而言，納米抗體在親和力方面與其對應的scFv相當，但在可溶性、穩定性、對聚集的抗性、可重折疊性、表達產率以及DNA操作、文庫構建和3-D結構測定的容易性方面超越scFv。