技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，特別涉及一種抗菌肽，編碼該抗菌肽的核苷酸序列以及制備該抗菌肽的方法。

背景技術

抗菌肽是一類具有生物活性的小分子多肽，具有殺菌力強、抗菌譜廣、穩定性好及不產生耐藥性等優點。更為重要的是抗菌肽對真核細胞幾乎沒有殺滅作用，僅作用于原核細胞。

查閱現有技術，發現中國專利201310553924.X公布了一種抗菌肽Cathelicidin-AM及其制備方法與應用。該發明專利通過構建cDNA文庫，轉化穿梭質粒，轉入枯草芽孢桿菌中表達。但是目的基因AM在枯草芽孢桿菌中的表達量受到限制、質粒轉化體不穩定，目的基因容易丟失等缺點。

發明內容

本發明的目的是提供一種抗菌肽Cathelicidin-AM1，以及編碼該抗菌肽的核苷酸序列和制備該抗菌肽的方法。

本發明提供的抗菌肽Cathelicidin- AM1，其特征在于，它含有SEQ ID NO：1中1至32位的氨基酸序列。

本發明還提供編碼上述抗菌肽的核苷酸序列SEQ ID NO：2。該核苷酸序列含有編碼SEQ ID NO：1中1至32位的氨基酸序列的基因序列。

本發明還提供了一種制備抗菌肽Cathelicidin- AM1的方法，包括以下步驟：

1）構建包含SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的重組桿狀病毒轉移載體。

2）將構建好的重組轉移載體與苜蓿銀蚊夜蛾多核型多角體病毒AcNPV-DNA共轉染Sf21真核細胞，按以下方式獲得表達抗菌肽Cathelicidin- AM1的重組病毒：

在1.5ml滅菌的Eppendorf管中加入5μg重組轉移載體DNA、15μg AcNPV-DNA及1.0ml共轉染緩沖液，將該混合物在室溫下孵育30min后共轉染對數期的Sf21細胞；然后將共轉染后的Sf21細胞先用無血清培養基Sf-900ⅡSFM培養基清洗兩次，再用含有10%FBS的完全培養基在27℃下培養4~6d，收集培養上清作為病毒原液用來篩選重組病毒，重組病毒經過空斑篩選，獲得病毒溶液，該病毒命名為含有抗菌肽Cathelicidin-JY1基因的重組病毒。

3）重組病毒感染生長旺盛的Sf21細胞，27℃培養4~6d進行感染表達，之后通過離心收集培養液。

與現有技術相比，本發明具有的有益效果是：

1、抗菌肽Cathelicidin- AM1 是一個經過修飾改進的基因，刪除了9種氨基酸密碼子，這種密碼子的改變，是制備得到的抗菌肽Cathelicidin- AM1具有更高的殺菌效價，特別是對多種病原微生物有較好的抑菌作用，如流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae ATCC49247）；副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus ATCC17802）；空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni ATCC29428）；金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus CMCC26003）；單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes ATCC19114） ；肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae ATCC49619）等。

2、本發明解決了抗菌肽Cathelicidin- AM1 在枯草芽孢桿菌表達中質粒轉化體不穩定、目的基因容易丟失等缺點，獲得的Sf21 細胞表達重組抗菌肽Cathelicidin- AM1具有較高的生物活性，且大部分被分泌到培養基中，有利于抗菌肽的快速提取純化。本發明的抗菌肽Cathelicidin- AM1可以大量生產，并且抗菌肽Cathelicidin- AM1在醫學、食品和化妝品上的應用開辟了廣闊的前景。

具體實施方式

以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明的方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。

實施例一：抗菌肽Cathelicidin- AM1基因克隆

根據抗菌肽Cecropin DC1 基因改造和克隆的需要，利用Primer premier 5.0 軟件設

計、合成引物：

P1：5’ - ATGGTGGGGTTCAAAGGC -3’；

P2：5’ - TGTGTTGTGCTGACACACTA -3’。