本發明涉及一組用于同時檢測潰瘍病菌、褐斑病菌和叢枝病植原體三種病原菌的核酸、試劑盒和檢測方法，其中，用于多重PCR同時檢測三種病原菌的核酸包括分別用于檢測潰瘍病菌、褐斑病菌和叢枝病植原體的上、下游引物；用于熒光定量PCR同時檢測三種病原菌的核酸還包括有各病原菌對應的探針。本發明還建立了一種比較高效、靈敏的，可同時檢測潰瘍病菌、褐斑病菌和叢枝病植原體這三種病原的檢測方法。該方法能有效提高檢測的靈敏度，避免假陰性結果的發生。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術，具體涉及一種用于潰瘍病菌、褐斑病菌和叢枝病植原體多重檢測的核酸、試劑盒及方法。

背景技術

苦楝(Melia azedarach)是我國重要的鄉土樹種之一，該樹種在濕潤的沃土上生長迅速，對土壤要求不嚴，在酸性土、中性土與石灰巖地區均能生長，是平原及低海拔丘陵區的良好造林樹種，該樹種也是良好的園林綠化樹種的用材樹種，此外也是高效、低毒的廣譜植物源農藥之一，苦楝產業在我國逐漸興起。近年來，苦楝的潰瘍病、褐斑病和叢枝病發病率逐漸上升，而且三者復合侵染的情況越來越多，給種植苦楝的用戶造成極大損失。目前尚缺乏苦楝的潰瘍病、褐斑病和叢枝病的高效殺菌劑和抗病品種，一旦發現有感染這三種病害，需要及時清除病樹，防止病害蔓延此外，還要加強非疫區的管理，防止這三種病害的侵入，因此，針對苦楝的潰瘍病原、褐斑病和叢枝病，建立早期快速定量檢測方法就顯得尤為重要。

苦楝潰瘍病主要為害葉片和枝梢。葉片染病，初在葉背產生黃色或暗黃綠色油漬狀小斑點，后葉面隆起，呈米黃色海綿狀物。后隆起部破碎呈木栓狀或病部凹陷，形成褶皺。后期病斑淡褐色，中央灰白色，并在病健部交界處形成一圈褐色釉光，凹陷部常破裂呈放射狀。枝梢染病，初生圓形水漬狀小點，暗綠色，后擴大灰褐色，木栓化，形成大而深的裂口，最后數個病斑融合形成黃褐色不規則形大斑，邊緣明顯。

苦楝褐斑病主要危害葉片，病斑先在頂部葉片的尖端發生，最初為淺黃色，逐漸變為黃褐色或深褐色，圓形或橢圓形，小病斑常匯集在一起，嚴重時在葉片上出現幾段甚至全部布滿病斑，在葉鞘和葉脈上出現較大的褐色斑點，發病后期病斑表現破裂，葉細胞組織呈壞死狀，散出褐色粉末，葉脈和維管束殘存如絲狀。

苦楝叢枝病主要由類菌原體和真菌所致，枝條受害后，因頂芽生長受到抑制而刺激側芽提前萌發成的小枝，不僅生長緩慢，且其頂芽不久也受到病原物的抑制，而刺激其側芽再萌發成小枝。如此反復進行，使枝條呈叢生狀。枝上的葉小而帶黃綠色，內部柵狀組織與海綿組織的分化不明顯。病枝初時可開花、結果，但花果往往畸形。漸后則花而不實，最后不開花。枝叢多能存活若干年，終因累生新的枝葉，養分消耗過度而枯死。由于枝條組織較正常者柔嫩，易遭凍害。

目前，潰瘍病菌的常規檢驗法有典型癥狀目測法、組織病理切片法和病原菌分離培養及致病性測定法。常規的致病性測定法可以測定病菌的存活狀態，因而可以正確評價檢疫性有害生物傳播擴散的危險性。但需要通過病原菌的分離培養、致病性測定來驗證。但常規方法檢測周期長，容易誤判。分離培養對于顯癥樣品可以取一小塊病健交界處的病組織，在滅菌蒸餾水中搗碎制成菌懸液。如果看不到癥狀，可以取混合葉片樣品，用蛋白胨磷酸緩沖液浸泡振蕩在室溫下富集培養6-8小時，然后將菌懸液直接或離心濃縮后在PSA或YSA培養基上劃線，28℃分離2-3天后選取全緣、隆起鮮亮的淡黃色圓形小菌落。可見現有的潰瘍病菌的檢測方法存在有檢測時間長等缺陷。

苦楝潰瘍病、褐斑病、叢枝病在廣東、海南、福建江西、安徽等省的苦楝種植區均由發生，嚴重林段發病率達50％以上，常造成苦楝大量死亡，已經成為部分地區發展苦楝種植及成片造林的嚴重阻礙。針對潰瘍病原、褐斑病原和叢枝病植原體的檢測方法，目前尚無能夠快速同時檢測這三種病原菌的方法。

發明內容

(一)要解決的技術問題

為了解決上述技術問題，本發明提供一種用于多重PCR同時檢測潰瘍病菌、褐斑病菌和叢枝病植原體的核酸，還提供了采用多重實時熒光定量PCR檢測潰瘍病菌、褐斑病菌和叢枝病植原體的核酸、試劑盒及其檢測方法。