本發(fā)明提供了竹葉花椒中期染色體的熒光原位雜交方法。包括竹葉花椒中期染色體載玻片標本的制備、熒光原位雜交、信號檢測及載玻片回收步驟。本發(fā)明有助于建立穩(wěn)定便捷的中期染色體熒光原位雜交反應體系，大大提高了竹葉花椒中期染色體的檢出效率，為竹葉花椒染色體乃至花椒屬物種染色體的檢測提供新方法。

技術(shù)領域

本發(fā)明屬于細胞遺傳學和分子生物學領域，具體涉及竹葉花椒中期染色體的熒光原位雜交方法。

背景技術(shù)

現(xiàn)有檢測植物染色體的方法普遍采用植物染色體分帶，分為兩大類，即熒光分帶和Giemsa分帶。但兩種方法均沒有在花椒屬植物中使用過。主要原因是：第一，花椒屬植物種子發(fā)芽不易，時間長，種子外殼較硬，不易吸水膨脹，利用種子發(fā)芽剪取根尖難。第二，根尖組織富含油脂，嚴重影響顯微鏡下染色體觀察，不利于找到染色體。第三，花椒屬植物染色體多、小，不易分散，不利于找到一個細胞中期染色體數(shù)目完整的分裂相。雖然花椒屬兩百多個物種，但目前已明確染色體數(shù)目的物種僅有9個物種：異葉花椒2n＝36，68，刺花椒2n＝64，竹葉花椒2n＝66，兩面針2n＝68，花椒勒2n＝68，氈毛花椒2n＝72，尖葉花椒2n＝72，野花椒2n＝ca.132，花椒2n＝136。這些物種的染色體數(shù)目，有些略微相同，有些接近呈2倍和4倍的關系。花椒屬物種目前還處于確定染色體數(shù)目的階段。花椒屬植物倍性也沒有明確。根據(jù)已報到的花椒屬物種染色體數(shù)目有些接近2倍和4倍關系，似乎花椒屬物種又存在多倍體，例如，染色體數(shù)目為36的物種可能是二倍體，染色體數(shù)目為64，68，72的物種可能是四倍體，染色體數(shù)目為132，136的物種可能是八倍體。但是，花椒屬植物一般是孤雌生殖，所以自然界中一般不容易自動出現(xiàn)多倍體。而人工選育品種多采用嫁接等無性繁殖方式，也不會增加物種倍性。因此推測花椒屬物種不應該是多倍體，而是二倍體。花椒屬更多物種染色體數(shù)目和物種倍性的確定，將有利于明確該屬物種基本背景知識，利于選育優(yōu)良品種。

熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)是在20世紀80年代末在放射性原位雜交技術(shù)基礎上發(fā)展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術(shù)，以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法，該技術(shù)使用熒光素標記探針、檢測分裂中期的染色體或分裂間期的染色質(zhì)的雜交。總體而言，F(xiàn)ISH具有安全性高、操作簡便快捷、穩(wěn)定性和重復性強等優(yōu)點。目前，該方法已經(jīng)廣泛應用于轉(zhuǎn)基因檢測及定位、異源染色體鑒定、基因組結(jié)構(gòu)解析等多個方面。但是FISH技術(shù)在操作過程中的酶解根尖制片過程、染色體變性過程、探針特異性、探針標記方法及效率等因素都是FISH能否雜交成功的關鍵因素。FISH技術(shù)已在很多植物上運用成功，目前還未見在任何一種花椒屬物種包括竹葉花椒中有應用報道。本發(fā)明提供一種竹葉花椒染色體的熒光原位雜交方法，建立穩(wěn)定便捷的染色體熒光原位雜交反應體系，克服了現(xiàn)有竹葉花椒染色體檢測的諸多問題，為竹葉花椒染色體乃至花椒屬物種染色體的檢測提供新方法。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種竹葉花椒中期染色體的熒光原位雜交方法。本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種竹葉花椒中期染色體的熒光原位雜交方法，包括以下步驟：

1)竹葉花椒中期染色體載玻片標本的制備：將竹葉花椒幼苗采用營養(yǎng)土培養(yǎng)，待根尖長至1.5～2.0cm時，剪取1～1.5cm根尖組織，依次用N₂O處理3h、冰醋酸處理5min，然后置于75％酒精中于-20℃保存；

將低溫保存的根尖組織以雙蒸水清洗后切取根尖分生組織1～2mm，置于酶解液中于37℃酶解55min，去除酶解液，依次用雙蒸水、75％酒精、95％酒精、100％酒精清洗根尖分生組織后室溫晾干；在根尖組織中加入冰醋酸制成懸浮液；將懸浮液滴于載玻片上室溫晾干后鏡檢，鏡檢良好的玻片于-20℃保存；