技術領域

本發明屬于生物基因工程技術領域，具體涉及由犬白蛋白、犬干擾素γ和犬干擾素α組成的融合蛋白及其制備方法。

背景技術

根據中國寵物行業現狀分析，截止到2014年末我國寵物行業的市場規模已經達到1058億人民幣，而中國寵物醫療行業目前僅占約20％，相比較寵物行業相對成熟的美國市場，其寵物醫療的產值比達到50％，中國寵物醫療行業存在巨大的發展空間。

犬是人類忠誠的朋友，隨著國內寵物犬等犬類飼養數量的大幅度增加，犬類疾病發病率、死亡率的不斷升高，給人類造成精神和經濟上的雙重損失。犬與人類親密接觸導致人類被犬病毒感染的幾率極高，如狂犬病毒、犬細小病毒和犬瘟熱病毒等，都會給人類健康帶來極大的威脅。

據相關科學研究報道干擾素作為一類重要的細胞因子，在對犬瘟熱、犬細小病毒病、犬傳染性肝炎和犬冠狀病毒病等疾病的治療中均具有一定的療效。因此積極研究干擾素在犬病毒性疾病治療中具有廣闊的應用前景。

IFN是一類病毒感染誘導機體產生具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和具有免疫調節作用的蛋白質，1957年Issacs和Lindeman首先發現，它是一類多功能的細胞因子，與細胞受體結合后，可誘導機體產生多種特異性蛋白質和酶類，主要通過抑制病毒基因轉錄和降解病毒RNA來抑制病毒的生長繁殖以及發揮抗腫瘤等的活性。現已知，α型IFN在體內可有選擇性地作用于病毒等感染細胞，通過抑制受染細胞內的病毒蛋白質的生物合成，發揮廣譜和高效抗病毒作用。但對正常宿主細胞無作用或作用微弱。IFN-α主要生物學活性為具有抑制病毒復制、抗寄生蟲、抑制多種細胞增殖、刺激免疫細胞的殺傷活性。

γ型IFN是由激活的T細胞和NK細胞產生，具有較強抗病毒和免疫調節功能。大量研究表明，干擾素γ除了具有廣譜抗病毒功能外，對免疫系統也起著關鍵的調節作用，所以IFN-γ又稱為免疫調節干擾素。雖然各種類型的干擾素均能夠介導細胞對病毒感染的反應，但干擾素γ的免疫調節活性在協調免疫反應和確定機體長期的抗病毒狀態中發揮更為重要的作用，因此干擾素γ具有極為重要的臨床應用價值。

血清白蛋白是血漿的重要成分，正常情況下不易透過腎小球，體內分布極廣而且沒有酶學和免疫學活性，是理想的藥物載體。白蛋白融合技術有以下優點：白蛋白與目標蛋白在細胞內經蛋白翻譯系統通過肽鍵鏈接，不需額外的體外處理；白蛋白的表達水平較高，與其融合后可以提高目的蛋白的表達水平；白蛋白是一個穩定的“惰性蛋白”，與其融合后可以提高目的蛋白的穩定性；白蛋白融合蛋白具有較長的藥物半衰期，將小分子蛋白藥物與白蛋白融合可有望提高在血液中的半衰期。目前，多種蛋白與白蛋白融合后在實驗動物體內半衰期的延長得到了證實。

天然干擾素及人工重組干擾素目前普遍存在半衰期短的局限，半衰期一般為2-4個小時。半衰期短給治療帶來了極大的不便，治療次數的增加，相應的時間成本及經濟成本隨之增加，而機體的耐受極限也有可能被突破導致不良反應的產生。半衰期短的主要原因有兩個：干擾素的分子量過小在體內代謝過快，干擾素尤其是重組干擾素親和力較差被免疫系統清除。

而市面上常見的長效干擾素以聚乙二醇融合干擾素為代表，僅在分子量的層面上部分解決了干擾素分子量小而導致半衰期短的問題，同時聚乙二醇融合干擾素成本非常高，不利于臨床上應用。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了一種由犬白蛋白、犬干擾素γ和犬干擾素α組成的融合蛋白及其制備方法，并由此融合蛋白與凍干保護劑混配之后，經冷凍干燥制備得到一種重組犬長效干擾素，所述重組犬長效干擾素可顯著提高犬干擾素的半衰期，較普通犬干擾素的半衰期提高19倍以上，并具有廣譜抗病毒作用并能提高犬自身的免疫應答。

本發明采取的技術方案為：

一種由犬白蛋白、犬干擾素γ和犬干擾素α組成的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示。

本發明還提供了編碼上述融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示，記為基因組1；或如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示，記為基因組2。