本發(fā)明公開了一種羊三聯(lián)四防亞單位疫苗及其制備方法，屬于動(dòng)物疫病防控領(lǐng)域。本發(fā)明由產(chǎn)氣莢膜梭菌β?ε融合蛋白、腐敗梭菌α毒素重組蛋白和佐劑組成。本發(fā)明克隆、表達(dá)的產(chǎn)氣莢膜梭菌C58?1株的β?ε(β和ε融合蛋白)和腐敗梭菌C55?2株α毒素蛋白，純化后與佐劑混合后配制成疫苗免疫小白鼠和家兔，利用《中國獸藥典》二〇一五年版三部關(guān)于羊“三聯(lián)四防疫苗”檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)合格，并且攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，免疫上述蛋白的動(dòng)物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌B型、C型、D型和腐敗梭菌具有100％保護(hù)力。因此，本發(fā)明可替代傳統(tǒng)“三聯(lián)四防”疫苗。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動(dòng)物疫病防控領(lǐng)域，特別涉及一種羊三聯(lián)四防亞單位疫苗及其制備方法。

背景技術(shù)

產(chǎn)氣莢膜梭菌（C. perfringens）最早是由英國人Welchii和Nuttad從一個(gè)腐敗的、產(chǎn)生氣泡的人尸血管中分離得到的，因此，曾被命名為魏氏梭菌（Cl. welchii）。產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種條件性致病菌，可引起多種動(dòng)物壞死性腸炎、腸毒血癥和創(chuàng)傷性氣性壞疽。牲畜方面，可引起羊腸毒血癥、羔羊痢疾、牛羊猝狙；中大豬和母豬脹氣及猝死、仔豬壞死性腸炎；馬、鹿、兔的梭菌性腸炎等。家禽方面，可引起雞、鴨、鴿等壞疽性皮炎和壞死性腸炎，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)不同菌株對(duì)α、β、ε、ι毒素產(chǎn)生的情況將該菌分為A（α）、B（α、β、ε）、C（α、β）、D（α、ε）、E（α、ι）5個(gè)型。很多菌株還產(chǎn)生腸毒素（C. perfingensenterotoxin, CPE）、β2毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素（PFO）、壞死性腸炎毒素（NetB）和產(chǎn)氣莢膜梭菌大分子細(xì)胞毒素（tpeL）。

梭菌外毒素是梭菌疫苗的有效免疫抗原，且利用滅活梭菌培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的毒素可實(shí)現(xiàn)梭菌性疾病的有效免疫。因此，培養(yǎng)此類細(xì)菌，使其大量生長繁殖并分泌高濃度、強(qiáng)毒力的毒素，可制備免疫效果優(yōu)良的疫苗。羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥三聯(lián)四防滅活疫苗（簡(jiǎn)稱羊三聯(lián)四防滅活疫苗）就是其中之一，在我國被廣泛使用。

常規(guī)羊三聯(lián)四防滅活疫苗生產(chǎn)中一般使用厭氣肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)厭氣梭菌，需要牛肉、肝、胃蛋白酶等原料，成本高，并且工藝復(fù)雜。另一方面，由于受到原材料品質(zhì)的影響（如抗生素的殘留、新鮮度等），培養(yǎng)基質(zhì)量不易控制，進(jìn)而影響疫苗的質(zhì)量。其次，常規(guī)苗具有免疫劑量大（5 mL/只）、免疫副反應(yīng)較高等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，解決現(xiàn)有技術(shù)中羊三聯(lián)四防疫苗生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本高、培養(yǎng)基質(zhì)質(zhì)量不易控制、進(jìn)而影響疫苗質(zhì)量且免疫劑量大、免疫副反應(yīng)較高的問題，本發(fā)明提供了一種羊三聯(lián)四防亞單位疫苗及其制備方法。本發(fā)明利用原核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)了魏氏梭菌株C58-1株的β-ε（β和ε融合蛋白）和腐敗梭菌C55-2株α毒素蛋白，純化后與佐劑混合后配制成疫苗，替代傳統(tǒng)“三聯(lián)四防”疫苗。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種羊三聯(lián)四防亞單位疫苗，由產(chǎn)氣莢膜梭菌β-ε融合蛋白、腐敗梭菌α毒素重組蛋白和佐劑組成。

作為優(yōu)選方案，所述產(chǎn)氣莢膜梭菌β-ε融合蛋白、腐敗梭菌α毒素重組蛋白、佐劑的重量比為1-3:1-3:1-3。

比如，本發(fā)明疫苗可由10mL 濃度為1.0mg/mL的產(chǎn)氣莢膜梭菌β-ε融合蛋白原液、10mL 濃度為1.0mg/mL的腐敗梭菌α毒素重組蛋白原液、20mL PBS溶液和10g鋁膠構(gòu)成。

作為優(yōu)選方案，所述產(chǎn)氣莢膜梭菌β-ε融合蛋白的制備方法如下：

根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌C58-1株β和ε基因序列設(shè)計(jì)六條特異性引物，引物序列為：pεb1947s1:GCTTTTCCTAGGGATG；

pεb1947s2: AATGATATAGGTAAAACTACTAC；