本發明屬于顯微光譜成像探測技術領域，涉及一種分光瞳激光共焦CARS顯微光譜測試方法及裝置。本發明的核心思想是融合分光瞳激光共焦顯微技術與CARS光譜探測技術，采用二向分光系統對瑞利光和CARS光進行無損分離，其中CARS光進行光譜探測，瑞利光進行幾何定位。本發明利用分光瞳激光共焦曲線頂點與焦點位置精確對應這一特性，精確捕獲和定位激發光斑焦點位置，實現高精度的幾何探測和高空間分辨的光譜探測，構成一種可實現樣品微區高空間分辨光譜探測的方法和裝置。通過結合CARS顯微技術，激發出的載有樣品信息的拉曼散射光要遠強于傳統自發拉曼光，且激發時間短，為快速檢測生物樣品和化學材料提供可能。本發明具有定位準確、高空間分辨、光譜探測靈敏度高和測量聚焦光斑尺寸可控等優點，在生物醫學，材料檢測等領域有廣泛的應用前景。

技術領域

本發明屬于顯微光譜成像技術領域，涉及一種分光瞳激光共焦CARS顯微光譜測試方法及裝置，可用于快速檢測各類樣品的微區反斯托克斯散射(CARS)光譜，可實現高空間分辨的幾何成像與探測，可獲得高空間分辨的“圖譜合一”圖像。

技術背景

光學顯微鏡在生物醫學領域和材料科學領域被廣泛應用，而隨著現代科學的快速發展，對顯微成像的要求也從結構成像轉向功能成像。1990年，共焦拉曼光譜顯微技術的成功應用，極大的提高了探索微小物體具體組織成分及形貌的可能。它將共焦顯微技術和拉曼光譜技術相結合，具備共焦顯微術的高分辨層析成像特征，又兼有無傷檢測和光譜分析能力，已成為一種重要的材料結構測量與分析的技術手段，廣泛應用于物理、化學、生物醫學、材料科學、石油化工、食品、藥物、刑偵等領域。

傳統的自發拉曼散射成像技術由于拉曼散射本身特性導致其發射信號極弱，即便用高強度的激光激發，要得到一副對比度好的光譜圖像，依然需要很長的作用時間。這種長時間作用限制了拉曼顯微技術在生物領域的應用。基于相干拉曼效應的相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)過程能夠很大程度上增強拉曼信號，從而實現快速檢測。相干拉曼效應是通過受激激發的光將分子鎖定在振動能級上，這種方法產生的振動信號的強度與激發光的強度成非線性關系，可以產生很強的信號，也稱為相干非線性拉曼光譜。它具有很強的能量轉換效率，曝光時間短，對樣品的損害也比較小，同時它的散射具有一定的方向性，容易與雜散光分離。

相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)的產生是一個三階非線性光學過程，它需要泵浦光、斯托克斯光和探測光。一般而言，為了減少光源的數量，簡化過程，常用泵浦光代替探測光，它們之間的關系如圖2所示，當泵浦光(w_p)和斯托克斯光(w_s)的頻率之差與拉曼活性分子的振動頻率相匹配時，將激發出CARS光w_as，其中w_as＝2w_p-w_s。CARS光的產生過程包含特定的拉曼活性分子的振動模式和導致分子從基態至激發態振動躍遷的入射光場的相互作用過程，它的能級示意圖如圖3所示。圖3(a)表示拉曼共振和非共振單光子增強對CARS過程的貢獻，圖3(b)表示拉曼共振和非共振雙光子增強對CARS過程的貢獻；當w_p和w_s之間的頻差與拉曼活性分子的振動頻率相匹配時，激發出的信號得到共振增強，同時非共振部分也會由于電子躍遷響應得到增強，因此要得到較好的CARS信號，需要盡可能的抑制非共振背景信號，常見的方法是偏振CARS(P-CARS)方法。

P-CARS的原理如圖4所示，光源1發出的頻率為w_p的斯托克斯光，起偏后經過四分之一波片和半波片后與光源2發出的頻率為w_s的泵浦光(探針光)匯合，經二向分光鏡后由反射鏡發射至水浸顯微物鏡，聚焦在樣品上，激發出載有光譜特性的CARS光后，透射進入信號采集系統；信號由一個油浸的顯微物鏡采集，經過一個偏振片過濾非共振背景，然后通過一個濾光片濾除其他譜段的干擾后，被一個雪崩光電二極管所采集，即獲得特定頻譜的光譜信號。

P-CARS能夠很大程度的抑制非共振信號和激發光的干擾，但是由于其采用的是兩個單波長激光器，只能獲得特定頻譜的光譜信息，因此它的廣泛使用受到了極大的限制。