本發(fā)明涉及一種軟X射線冷凍成像樣品的制備方法，步驟如下：(1)在基片上沉積低表面能材料層；(2)根據(jù)細(xì)胞樣品的特征以及軟X射線冷凍成像設(shè)備的樣品座進(jìn)行掩模設(shè)計(jì)；(3)在沉積有低表面能材料的基片上制作細(xì)胞樣品模具結(jié)構(gòu)；(4)將需要與軟X射線冷凍成像設(shè)備樣品座相連接的部件放入細(xì)胞樣品模具結(jié)構(gòu)中，滴加細(xì)胞樣品水溶液，并快速浸入到低溫液體中進(jìn)行冷凍；(5)冷凍后形成的無定形冰與細(xì)胞樣品模具發(fā)生分離，獲得自支撐冷凍細(xì)胞樣品。利用本發(fā)明制備的自支撐冷凍細(xì)胞樣品進(jìn)行軟X射線冷凍成像，可以滿足完整角度X射線成像且減少光子能量損耗，能有效地提高軟X射線冷凍成像能力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種軟X射線冷凍成像樣品的制備方法，屬于冷凍細(xì)胞樣品顯微成像技 術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

軟X射線冷凍成像是一種研究細(xì)胞自然狀態(tài)下超微結(jié)構(gòu)的重要方法，可以為細(xì)胞生 物學(xué)提供重要的信息。在波長為2.34-4.37nm的水窗區(qū)域，富含碳和氮的生物成分對X射線的吸收強(qiáng)度比水大一個(gè)數(shù)量級，因此樣品無需脫水和染色即可得到高襯度成像。此外，不同生物結(jié)構(gòu)中，各種元素的含量比例不同，因此吸收襯度也不同，重構(gòu)后獲得的 不同結(jié)構(gòu)的線性吸收系數(shù)分布就會不一樣。根據(jù)該性質(zhì)可區(qū)分樣品中的不同結(jié)構(gòu)，如細(xì) 胞中的核糖體、液泡、線粒體等(Uchida M.,Yeast.28,2011:227-236)，它提供了高信噪 比、分辨率為幾十納米的吸收襯度成像。通過X射線斷層掃描技術(shù)(CT成像)能夠獲 得更加豐富的結(jié)構(gòu)信息，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的三維成像。

冷凍細(xì)胞樣品的制備是軟X射線冷凍成像的重要環(huán)節(jié)，良好的制樣是獲得高質(zhì)量成 像的必要前提。現(xiàn)有的軟X射線冷凍成像樣品制備大多采用電鏡用銅網(wǎng)，制樣過程相對簡單。但是，當(dāng)樣品旋轉(zhuǎn)到高角度時(shí)使用的銅網(wǎng)會限制樣品信息的采集，造成樣品信息 的角度缺失。由于角度受限，三維圖像重構(gòu)效果往往不理想，重構(gòu)的樣品結(jié)構(gòu)形態(tài)和線 性吸收系數(shù)都有偏差，在角度缺失的方向會形成楔形偽跡，這給樣品數(shù)據(jù)的后期定量計(jì) 算和分析帶來困難(Z.Liang.,Synchrotron Rad.23,2016:606-616)。為了解決角度缺失問題， 出現(xiàn)了基于毛細(xì)管的樣品制備方法。薄壁玻璃毛細(xì)管可以實(shí)現(xiàn)完整角度的數(shù)據(jù)收集，因 此消除了使用銅網(wǎng)所造成的角度缺失問題，可以給出較好的三維重構(gòu)結(jié)果。但是，這種 制樣方法又會帶來其他問題。毛細(xì)管細(xì)胞樣品由石英玻璃管制做，管壁約幾百納米，而 軟X射線水窗波段內(nèi)石英的吸收系數(shù)比較大，毛細(xì)管會吸收超過一半的光子，這大大降 低了光子的利用率和成像襯度，增長了曝光時(shí)間，給提高軟X射線冷凍成像的分辨率帶 來了困難。為了進(jìn)一步克服毛細(xì)管對于成像的限制，有人采用碳納米管進(jìn)行制樣，在冷 凍電鏡成像上取得了一定的效果。但在軟X射線冷凍成像中，碳納米管的引入會對生物 成像造成極大干擾(Colin M.Palmer,Ultramicroscopy,137,2014:20-29)。因此，對于軟X 射線冷凍成像樣品的制備，始終沒有較好的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有的軟X射線冷凍樣品制備方法中的成像角度缺失以及能量損失問題，提出一種軟X射線冷凍成像樣品的制備方法，通過制作自支撐結(jié)構(gòu)的冷凍 樣品來解決上述問題，可以滿足完整角度X射線成像且減少光子能量損耗，有效地提高 軟X射線冷凍成像能力。

本發(fā)明要實(shí)現(xiàn)的自支撐冷凍細(xì)胞樣品如圖1所示。圖1中包括細(xì)胞樣品模具和在快速冷凍后從細(xì)胞樣品模具中脫離形成的自支撐冷凍細(xì)胞樣品。其中，1為細(xì)胞樣品模具： 灰色邊框的用途為將細(xì)胞樣品限制在所設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)中，中間凹陷的區(qū)域?yàn)榧?xì)胞樣品的填 充區(qū)域。自支撐冷凍細(xì)胞樣品分為兩部分：凸字形的成冰區(qū)和連接機(jī)構(gòu)。成冰區(qū)為低溫 速凍后形成的以冰為主體的脫離細(xì)胞樣品模具的部分，分為細(xì)小頂部的成像區(qū)(2)和 底部的連接區(qū)(3)。其中，頂部的微米尺寸部位為進(jìn)行軟X射線冷凍成像的細(xì)胞樣品 區(qū)，底部尺寸較大的區(qū)域?yàn)閷?shí)現(xiàn)自支撐冰結(jié)構(gòu)與外界連接的連接區(qū)。連接機(jī)構(gòu)(4)的 功能是為了將成冰區(qū)連接到軟X射線冷凍成像設(shè)備的樣品座上。

獲得自支撐冷凍細(xì)胞樣品的關(guān)鍵是：細(xì)胞樣品在經(jīng)低溫快速冷凍后如何從基片上脫 離，形成自支撐結(jié)構(gòu)。通常，水在物體表面凍結(jié)成冰并連成一體的過程可以分為兩步：