本發明提供了一種3D復層結構細胞膜片的制備及其應用，包含如下步驟：兩步分離法，分離人皮膚干細胞、基底角質細胞和黑色素細胞；3D復層結構表皮細胞膜片的培養方法：三種細胞無血清混合培養擴增及細胞的誘導分化培養出表皮細胞的3D復層結構細胞膜片；3D復層結構細胞膜片的剝離備用；3D復層結構細胞膜片的移植：用皮膚打磨機將白癜風皮損處磨至點狀滲血，將復層結構表皮細胞膜片貼在打磨處，用敷料包扎。兩步分離法同時分離三種不同細胞，分離細胞表面的膜受體和膜蛋白保持完整；3D復層結構細胞膜片中黑色素細胞和表皮細胞比例接近正常人表皮結構；可用于皮膚色素脫失性皮膚病的治療及各種創傷的治療。

技術領域

本發明涉及一種3D復層結構細胞膜片的制備及其應用，尤其是一種利用人自體黑色素干細胞、短暫擴充細胞、毛囊干細胞、濾泡間表皮干細胞(Interfollicle EpidermalStem Cell，(IFESCs)皮脂腺干細胞、基底層角質細胞為種子細胞，培養具有3D復層結構表皮細胞膜片的技術及其在臨床中的應用。

背景技術

皮膚由表皮真皮和皮下組織組成，是人體最大最復雜的器官，具有保護、分泌、感知和代謝功能。皮膚缺損和燒傷等是臨床上的常見疾病，其最主要治療的方法是自體皮膚移植或采用臨時皮膚替代物覆蓋；此外，白癜風也是一種皮膚色素脫失性疾病，發病機制目前還不清楚，治療方法有激光照射等物理治療法、藥物治療法和自體表皮移植法等方法。表皮移植法均需要自體皮膚，然而，由于人體皮膚有限，因此，人們一直在尋找一種永久性皮膚替代物，而永久性皮膚替代物仍依賴于有活性的自體多種種子細胞，主要包括各種表皮干細胞。

表皮干細胞(祖細胞)是一類異質性細胞，具有不同的亞類，其分子特征、分化能力及細胞巢(resident sites)都不相同。表皮干細胞主要包括：毛囊干細胞(HFSCs)、毛囊外根鞘干細胞、表達keratin-15的毛囊多潛能干細胞(follicle pluripotent stem cells，fPSCs)、皮脂腺干細胞(SGSCs)、汗腺干細胞(sweat stem cell)和黑色素干細胞(melancyte stem cell，EPI-NCSCs)和濾泡表皮干細胞(IFESCs)。

表皮干細胞具有終身、無限的自我更新能力。它是一種具有產生至少一種以上高度分化子代細胞潛能的細胞。從發生機制來看，干細胞并不直接分化產生終末分化細胞，而是先分化成短暫擴充細胞，短暫擴充細胞有產生定向分化成某種終末分化細胞的能力，因而是定向祖細胞。短暫擴充細胞再經過幾次到十幾次不等的分裂后定向分化，進一步可分化為有絲分裂后細胞及終末分化細胞。

短暫擴充細胞的存在說明組織靠較少量的干細胞分裂為很多的子代分化細胞。干細胞自我更新和分化的方式通常有兩種，一種是不對稱方式分裂，即1個干細胞分裂成1個干細胞和一個定向祖細胞，常見于單細胞生物和無脊椎動物；另一種是具有高度調控機制的分裂方式，干細胞按一定的概率分裂成干細胞或定向祖細胞，即干細胞按一定的概率分裂為兩個干細胞或兩個定向祖細胞，或按不對稱方式分裂，一般認為哺乳類動物即以此種方式進行自我組織更新。細胞的更新具有準確無誤性，干細胞在整個增殖過程中處于相對靜止狀態，而由短暫擴充細胞完成DNA合成和細胞擴充的任務，干細胞在分裂后仍保留其原有的遺傳信息，短暫擴充細胞擁有新復制DNA序列，以保證差錯僅停留在短暫擴充細胞水平。通常干細胞等數分裂干細胞和定向祖細胞，當受到損傷等情況時，干細胞的分裂方式會發生改變以適應機體的需要。

皮膚上皮層是一層保護機體免受外界環境損傷的重要屏障。該層主要為角質細胞類型，包含了大約85％活的表皮細胞。角質層是復扁平上皮細胞。在表皮基底層，角質細胞分化、增殖，隨著角質細胞產生角蛋白并上移至表皮表面后，發生程序性死亡。

角蛋白細胞增殖、分化及凋亡是復雜且嚴格控制的過程。角蛋白細胞可產生很多細胞因子和生長因子，包括IL-1，IL-3，IL-6，IL-8，集落刺激因子，TNF-alpha，TGF-alphaand beta，成纖維細胞生長因子，雙調蛋白和PDGF。