本發明涉及組織工程口腔黏膜上皮細胞片的制備方法。具體地，本發明提供一種口腔黏膜上皮細胞片的制備方法，包括以下步驟：(a)口腔黏膜組織采集步驟；(b)口腔黏膜上皮細胞提取步驟；(c)口腔黏膜成纖維細胞提取步驟；(d)上皮細胞培養基質和培養支架制備步驟；(e)口腔黏膜上皮細胞與口腔黏膜成纖維細胞共培養步驟；以及(f)制備得到的上皮細胞片與同培養材料的分離步驟。

技術領域

本發明涉及組織工程與生物制品領域，具體地，本發明涉及一種用于角膜疾病(尤其是角膜眼表疾病)治療的上皮細胞片的制備方法及其應用。

背景技術

人的眼角膜共分5層，由前向后依次為：上皮細胞層、前彈力層、基質層、后彈力層和內皮細胞層。上皮細胞層是最外面的一層，厚度約為50微米，占整個角膜厚度的10％，由5-6層細胞所組成。角膜周邊部上皮增厚，細胞層數增加到8-10層。角膜上皮共有3種類型的細胞：基底細胞、翼狀細胞、扁平細胞。上皮細胞間以橋小體相接，構成致密的質膜，這層致密堅固的屏障可阻止大部分微生物的侵入，阻止淚液中液體和電解質進入基質層，使得角膜處于相對脫水狀態。由于外界原因和/或自身原因角膜上皮層會發生各種損傷和/或病變，情況嚴重導致失明。

化學傷、熱灼傷或其他疾病(例如，Steven-Johnson、眼天皰瘡等)可導致眼表損傷，破壞角膜上皮的結構和功能。目前，目前臨床治療主要依賴于異體角膜移植，但供體材料來源有限等困難嚴重制約了這一治療方法的應用。而且，異體角膜移植仍然存在術后免疫反應，甚至出現供體排斥而致手術失敗。

此外，現有治療方法還包括人工角膜移植。目前，已有多種人工角膜應用于臨床，但其材料均達不到理想要求。而且，由于人工角膜的晚期并發癥：角膜溶解、植入物排出、房水滲漏、眼內炎、人工角膜后增生膜、青光眼等，目前僅適用于常規角膜移植失敗的雙眼角膜混濁性失明患者，一般只作為最后的選擇。

還可采用的另一種治療方法是：羊膜移植。人羊膜可作為基底膜、促進上皮細胞增殖和分化以及抗炎癥抗粘連等用于眼表疾病的治療，但羊膜是來源于異體組織，難免會帶來供體的相關物質，其安全性值得考慮。

最近新起的一種治療方法是：生物角膜移植，生物角膜雖然可以解決供體緊張及人工角膜缺陷的一些問題，但其來源是異種屬，難以避免排異反應，其安全性值得考慮。

隨著組織特異性干細胞知識的不斷深入以及組織工程技術的飛速發展，自體角膜緣干細胞體外培養形成細胞片，用于眼表損傷的重建取得令人滿意的臨床效果。但是對于雙眼眼表損傷的患者，因沒有健康的角膜緣組織可供取材，故無法開展。

因此，本領域迫切需要一種更佳的角膜損傷治療方法，既能解決供體不足的問題，同時也能避免異體移植可能發生的排斥反應以及長時間使用糖皮質激素和免疫抑制劑帶來的一系列不良反應，從而為LSCD患者提供了個體化可行性治療方案。

發明內容

在本發明的一方面，提供了一種口腔黏膜上皮細胞片的制備方法，包括以下步驟：

(a)口腔黏膜組織采集步驟；

(b)口腔黏膜上皮細胞提取步驟；

(c)口腔黏膜成纖維細胞提取步驟；

(d)上皮細胞培養基質和培養支架制備步驟；

(e)口腔黏膜上皮細胞與口腔黏膜成纖維細胞共培養步驟；以及

(f)制備得到的上皮細胞片與同培養材料的分離步驟。

在本發明一些優選的實施方式中，所述步驟(b)中口腔黏膜上皮細胞采用Ⅰ型中性蛋白酶聯合胰蛋白酶進行消化。

在本發明一些優選的實施方式中，所述步驟(c)中口腔黏膜成纖維細胞采用經Ⅰ型中性蛋白酶消化后的結締組織塊貼附培養法培養提取。