技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及優化的谷氨酰胺轉氨酶基因和優化的谷氨酰胺轉氨酶前導序列，及其分泌、表達、應用。

背景技術

谷氨酰胺轉氨酶(Transglutaminase，TG)能夠催化蛋白質肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基與各種酰基受體發生酰基轉移反應，是一種有效的蛋白質交聯劑。目前該酶應用最廣泛的是在肉制品行業以改善蛋白質的結構和功能性質，提高營養價值。近年來，TG在生物醫藥、組織工程、定點蛋白交聯、紡織和皮革處理等多個領域擁有十分廣闊的應用前景。

微生物來源的谷氨酰胺轉氨酶(Microbial transglutaminase，MTG)的生產菌株主要是鏈霉菌，如茂源鏈霉菌(Streptomyces mobaraense)、吸水鏈霉菌(Streptomyces hygwscopicus)。鏈霉菌MTG是一種胞外酶，以無活性的酶原(pro-MTG)形式分泌，pro-MTG的N-端酶原區需要被菌體內生的金屬蛋白酶(TAMEP)及絲氨酸蛋白酶(serine protease)切除后，才能轉化成活性MTG。由于原生產菌株分子改造困難、自身分泌大量蛋白酶且產量提高潛力有限，傳統發酵生產MTG遠不能滿足市場需求。效價比較高的谷氨酰胺轉氨酶仍然依賴于國外進口，但進口酶的價格昂貴，使企業的生產成本增加。隨著MTG的應用范圍不斷擴展，獲得產量高、穩定性好、專一性強、酶活力高的谷氨酰胺轉氨酶制劑是市場所要求的。

使用異源表達系統已成功實現了鏈霉菌pro-MTG或MTG的基因的表達，但是克隆表達成熟酶基因mtg直接分泌有活性的酶MTG的策略尚未獲得成功。目前，表達活性MTG的策略主要有兩種，一種是將pro-MTG與SAM-P45蛋白酶在異源宿主中共同分泌表達，但此種策略由于發酵液中殘存的蛋白酶活力可能持續降解活性TG而造成不利影響，以及蛋白酶的后續去除會提高分離純化的成本，因此，不適合工業化要求。另一種是Yurimoto等、李鵬飛等采取將微生物來源的酶原pro-MTG的前導序列(pro)和成熟谷氨酰胺轉氨酶(mtg)編碼區作為兩個獨立的元件進行共表達的策略，成功地實現了直接分泌表達活性MTG，但是酶活水平仍然較低。而李鵬飛采取不同于Yurimoto的共表達策略，通過分別構建pro和mtg的基因表達盒，用SolutionⅠ連接酶連接后放在一個表達載體上，獲得pro/MTG共表達載體pAOα-pro-MTG，在酵母中也直接分泌表達活性MTG，但是表達量、酶活水平仍然較低。共表達策略的重要優勢就是無需蛋白酶活化就能夠得到活性的MTG，然而，目前關于mtg及其pro共表達的報道很少。

發明內容

基于背景技術存在的技術問題，本發明將從分子水平對源于茂源鏈霉菌的谷氨酰胺轉氨酶基因(mtg)及其前導序列(pro)進行改造得到優化基因，使優化后的mtg及pro降低轉錄能量屏障，提高轉錄效率，提升其在畢赤酵母中的分泌表達水平。并運用pro和mtg作為兩個獨立的元件進行共表達的策略構建共表達重組畢赤酵母體系，實現在酵母中直接分泌表達活性MTG，并使優化外源基因在酵母細胞中獲得高效穩定表達。

本發明采用源于茂源鏈霉菌的谷氨酰胺轉氨酶基因(mtg)及其前導序列(pro)作為原始基因和原始前導序列。

本發明的目的在于提供一種優化的谷氨酰胺轉氨酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；而谷氨酰胺轉氨酶原始基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發明谷氨酰胺轉氨酶基因相對于谷氨酰胺轉氨酶原始基因，其GC含量由原來的64.56％減少到39.94％；CAI值由原來的0.54提高到0.97。

本發明的目的還在于提供一種優化的谷氨酰胺轉氨酶前導序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；而谷氨酰胺轉氨酶原始前導序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本發明前導序列相對于谷氨酰胺轉氨酶原始前導序列，其GC含量由原來的67.41％減少到43.7％；CAI值由原來的0.46提高到0.97。

同時本發明優化后的基因和前導序列在宿主細胞中的分泌表達量高。

本發明的目的還在于提供一種包含上述優化的谷氨酰胺轉氨酶基因的表達載體。

本發明的目的還在于提供一種包含上述優化的谷氨酰胺轉氨酶前導序列的表達載體。