[發明專利]利用玉米異源多倍體培育玉米-大芻草單體附加系的方法有效
| 申請號： | 201710053009.2 | 申請日： | 2017-01-24 |
| 公開（公告）號： | CN106818459B | 公開（公告）日： | 2019-01-25 |
| 發明（設計）人： | 唐祈林;王紅林;李曉鋒;程明軍;李楊;何如鈺;孫汝龍;李靜;謝孟林;嚴旭;趙艷麗;馬行云;穆罕默德·扎法爾·伊克巴爾;周樹峰;吳元奇 | 申請（專利權）人： | 四川農業大學 |
| 主分類號： | A01H1/02 | 分類號： | A01H1/02;A01H1/04 |
| 代理公司： | 北京修典盛世知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11424 | 代理人： | 胡長遠 |
| 地址： | 611130 四*** | 國省代碼： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 利用 玉米 多倍體 培育 大芻草 單體 附加 方法 | ||
1.利用玉米異源多倍體培育玉米-大芻草單體附加系的方法，其特征在于包括以玉米異源六倍體為母本，以玉米為父本雜交，收獲結實籽粒，得F1代；然后對F1代的染色體組成進行鑒定，選擇染色體總數為45～55條、且大芻草染色體數為1～20條的植株；再以所選的植株為母本，以玉米為父本回交，獲得BC1代；對BC1代進行染色體組成進行鑒定，然后選擇染色體總數為21～39條、且大芻草染色體數為1～5條的后代為母本，以玉米為父本繼續回交，得BC2代；選擇BC2代中染色體總數為21，其中玉米染色體為20條、大芻草染色體數為1條的材料，即為玉米-大芻草單體附加系；其中所述的玉米異源六倍體是指MTF-1或其衍生系；所述的衍生系是指以MTF-1為母本，以玉米、四倍體多年生類玉米或摩擦禾為父本雜交，選擇包含玉米、四倍體多年生類玉米和摩擦禾三個物種全套染色體的后代，所得的新的異源六倍體。
2.利用玉米異源多倍體培育玉米-大芻草單體附加系的方法，其特征在于其具體步驟如下：
（1）、從三月下旬開始，分10批種植玉米，每批20株，每批間隔3天；四月上旬將玉米異源六倍體種植于花盆內；
（2）、在吐絲前將玉米異源六倍體雌穗套袋，并在授粉前將其花絲剪短至2～3cm，然后以玉米為父本給玉米異源六倍體雌穗授粉，每個雌穗至少重復授粉3次，每次授粉后都在套袋上作標記，成熟時收獲種子，獲得F1代；
（3）、次年4月，將步驟（2）所得的F1代種子種植在人工氣候箱的營養缽中，在28℃、濕度為70%的條件下催芽，植株生長至2葉1心時移栽至花盆中種植；待植株株高≥30cm時，在晴天上午10：00～12:00、且氣溫高于25℃時，取根尖，采用染色體壓片技術鑒定體細胞染色體數目，利用原位雜交技術鑒定染色體組成，每個單株至少統計50個細胞；選擇染色體數為45～55條、且大芻草染色體數為1～20條的植株做母本，在雌穗吐絲前套袋，吐絲后剪短花絲至1～2cm，以玉米為父本進行授粉，在第1次授粉后隔2天重復授粉1次，每個雌穗至少重復授粉3次，成熟時收獲種子，得BC1代；其中所述的玉米與步驟（1）一樣進行分期種植；
（4）、按照步驟（3）中所述的方法種植所得的BC1代，并按照步驟（3）中所述的方法采用染色體壓片和原位雜交技術對BC1代根尖染色體數目和組成進行鑒定；選擇BC1代中染色體總數為21～39條且大芻草染色體數為1～5條的植株；用玉米作為父本給所選的BC1代植株授粉，收獲得BC2代；
（5）、按照步驟（3）中所述的方法種植BC2代，采用染色體壓片技術對根尖染色體數目進行鑒定，BC2代材料染色體總數只有20條和21條的兩種類型；
（6）、利用火焰干燥法對步驟（5）中染色體數目為21條的植株剩余根尖進行染色體制片，選擇染色體處于中期且分散度較高的根尖燃片進行雙色基因組原位雜交，分別用地高辛和生物素標記玉米和大芻草總基因組DNA，鑒定染色體組成；選擇根尖細胞染色體數目為21條，且其中含有20條玉米染色體和1條大芻草染色體的材料，即為玉米-大芻草單體附加系；
所述的玉米異源六倍體均指MTF-1或其衍生系；
所述的衍生系均指以MTF-1為母本，以玉米、四倍體多年生類玉米或摩擦禾為父本雜交，選擇包含玉米、四倍體多年生類玉米和摩擦禾三個物種全套染色體的后代，所得的新的異源六倍體。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的玉米是指普通栽培玉米，所述的玉米是雜交種、自交系、地方品種或綜合種。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于其步驟（3）中所述的染色體數為45~50條；所述的大芻草染色體數為1~10條。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于其步驟（3）、（4）或（5）中所述的染色體壓片的方法為：在晴天上午10：00～12:00、且氣溫高于25℃時，取根尖，并用α-溴萘飽和水溶液預處理3 h，將預處理后的根尖在室溫下用雙蒸水低滲30min，然后用甲醇和冰乙酸以體積比為3：1的比例配制的新鮮固定液固定12h以上，再將固定后的根尖置于70%無水乙醇中，保存在4℃中過夜，用雙蒸水洗凈根尖上的固定液，用等量混合的6%纖維素酶與1%果膠酶，在37℃酶解根尖2.5h，酶解后的根尖用改良后的卡寶品紅染色進行壓片，顯微照相并統計染色體數目。
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