技術領域

本發明涉及一株無成瘤性MDCK細胞克隆株。

背景技術

MDCK細胞（Madin-Daby Canine Kidney Cells, MDCK）由Madin和Darby于1958年從美國Cocker Spaniel母曲架犬腎臟組織分離培育建立，由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易變異，是公認的適于流感病毒復制的3種細胞系之一。

流感(Influenza) ，是由甲(A) 、乙(B) 、丙(C) 三型流感病毒分別引起的急性呼吸道傳染病，常造成不同程度的流行，包括世界大流行、局部暴發流行及散發。禽流感（Bird Flu或Avian Influenza）是禽流行性感冒的簡稱，它是由甲型流感病毒的一種亞型（也稱禽流感病毒）引起的一種急性傳染病，也能感染人類，通常人感染禽流感死亡率約為33%。目前為止無論是流感還是禽流感未找到理想的治療藥物，疫苗接種仍是當今防止疾病發生和流行最有效的手段。

我國流感疫苗和禽流感疫苗生產主要采用雞胚生產工藝，雞胚生產工藝存在生產周期長、操作繁瑣、工作量大、易污染等諸多缺陷，如遇禽流感大規模爆發，雞胚的供應也將存在很大問題。若采用傳代細胞生產疫苗的工藝將不受雞胚等天然因素的限制，且生產周期短，工藝簡單，如遇流感暴發會快速反應，短時間內可提供大量疫苗產品。另外，貼壁型的傳代細胞可用生物反應器微載體規模化培養，生產中可將細胞生長和病毒繁殖自動控制在最適條件范圍內，提高細胞密度和病毒滴度，實現大批次量、小批間差，產品具有更好的穩定性和安全性，大量節省勞動力、生產場地和能源消耗，降低生產成本，與雞胚直接增殖病毒的工藝和轉瓶培養傳代細胞增殖病毒的工藝相比具有明顯優勢。

目前國際上已有幾家企業已批準利用MDCK細胞生產流感疫苗。荷蘭蘇威制藥公司（Solvay Pharmaceuticals）生產的流感病毒裂解疫苗Influvac?TC于2001年在荷蘭獲得批準。諾華公司（Novartis Vaccines）經過馴化獲得的MDCK細胞株生產的Optaflu?于2007年獲得了歐洲藥品審評署（EMEA）的批準，Optaflu?在歐盟27個成員國、冰島和挪威得到了廣泛的使用。Optaflu?的上市標志著近50年流感疫苗生產史最重大的創新之一。Flucelvax?滅活疫苗（甲型流感病毒亞型和乙型流感病毒）于2012年11月獲得美國FDA批準用于18歲以上成人流感預防接種。阿斯利康(AstraZeneca)旗下的MedImmune公司生產的4價減毒活疫苗Flumist?于2010年獲得美國FDA的批準用于2-45歲人群接種。

MDCK細胞用于流感疫苗生產的主要爭議是因為其具有成瘤性。2005年11月16日疫苗和相關生物制品顧問委員會（VRBPAC）組織召開的會議討論了MDCK細胞作為細胞基質用于流感疫苗生產的相關事宜，并且著重討論了MDCK細胞的成瘤性問題。會議期間諾華公司、荷蘭蘇威制藥公司、美國醫學免疫學公司分別做了MDCK細胞的研究報告。諾華公司的研究報告顯示無血清懸浮培養型MDCK細胞的成瘤性非常強，10個細胞就可以對裸鼠成瘤，但是對該公司通過馴化獲得的MDCK細胞株33016-PF的研究顯示該細胞株對裸鼠不成瘤。荷蘭蘇威制藥公司的研究報告顯示MDCK細胞（CCL-34）母細胞（P56）接種的細胞量高于10⁷細胞對裸鼠成瘤，建立的細胞庫細胞傳代至P98代時接種10⁵細胞量就對裸鼠形成腫瘤。美國醫學免疫學公司生產流感疫苗使用的細胞是該公司自主研發獲得的無成瘤性MDCK貼壁細胞株，接種10⁷細胞量對裸鼠不成瘤。目前，獲得無成瘤性MDCK細胞株仍是各國科研人員研究的重點。

發明內容

本發明提供了一株無成瘤性MDCK細胞克隆株。本發明對ATCC引進的MDCK細胞（CCL-34）母細胞（P55）通過單細胞克隆、染色體分析和裸鼠接種篩選得到了無成瘤性的MDCK細胞克隆株，并在中國典型培養物保藏中心（CCTCC）進行了保藏，保藏編號為：C2016150，分類命名：犬腎細胞MDCK-C09，保藏日期為：2016年7月27日，保藏地址為：湖北省武漢市武昌區八一路299號武漢大學。

本發明的第一個目的是提供無成瘤性MDCK細胞克隆株，所述無成瘤性MDCK細胞克隆株保藏于中國典型培養物保藏中心，分類命名：犬腎細胞MDCK-C09，保藏編號為：C2016150。

本發明的第二個目的是提供無成瘤性MDCK細胞克隆株在流感疫苗生產中的應用。

作為優選，所述MDCK細胞克隆株作為細胞基質用于流感疫苗生產。