技術領域

本發明涉及基因轉染技術領域，具體涉及一種瞬時轉染試劑及其應用方法，是一種可以高效簡便毒害小的轉染試劑。

背景技術

轉染需要一定的轉染試劑將帶有目的基因的載體運送到宿主細胞內。目前，最常用的轉染試劑是陽離子脂質體和陽離子聚合物，它們的特點和病毒類似，容易透過細胞膜。其中，陽離子脂質體在體外基因轉染中有很高的效率，然而在體內，它迅速被血清清除，在肺組織內累積，誘發強烈的抗炎反應，這將導致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其應用。由于陽離子脂質體的局限性，陽離子聚合物轉染試劑日益受到重視。

本試劑采用陽離子聚合物為主要成分，可以與 DNA 形成穩定的復合物，保護 DNA 免受核酸酶的降解，在增加核酸穩定性的同時，提高轉染試劑/DNA復合體穿越細胞膜的效率，這種獨特設計，顯著提高了基因轉染效率。此類試劑是目前非病毒介導方法中效率極高的轉染試劑（不同種類細胞的轉染效率可有明顯差異），可與lipo3000相媲美。此外此轉染試劑不被血清清除，血清和抗生素不影響其轉染效果，轉染試劑/DNA 復合物可以直接加入完全細胞培養基中。它的細胞毒性很小，在適宜的條件下，根據推薦用量使用其進行轉染實驗，細胞存活率高于95%。

發明內容

針對現有轉染試劑的不足，本發明提供一種瞬時轉染試劑及其應用方法，具有轉染效率高且穩定、細胞毒性小、操作簡便省時、溶液穩定、適應宿主細胞范圍廣等優點。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種瞬時轉染試劑，其成分為：高效線性聚乙烯亞胺PEI-MAX和ddH₂O,溶液PH為7.05。

在使用該瞬時轉染試劑轉染質粒時，質粒與轉染試劑比例介于1微克:1.5微升至1微克:4微升之間，最優比例為1微克:3微升。

本發明的另一目的在于提供一種上述瞬時轉染試劑的使用方法，包括如下步驟：

（1）將轉染質粒和轉染試劑按照比例混合，用opti-MEM或者ddH₂O稀釋；

（2）室溫孵育5min后加入到DMEM培養基中；

（3）24-36h后即可進行檢測。

該瞬時轉染試劑溶液穩定性高，在4℃及-20℃條件下均可以長期保存；轉染效率高；細胞毒性低，細胞存活率高于95%。

本發明的優點在于成本低廉，轉染效率高，適合宿主范圍廣，轉染方便快捷，對細胞毒性小，溶液穩定性高。

附圖說明

圖1 DNA（3μg GFP質粒）和轉染試劑不同的比例轉染，轉染后24h顯微鏡觀測蛋白表達情況，推薦使用1:3轉染；

圖2 GFP和mcherry質粒各1.5μg，按照不同的比例做轉染，轉染后24h顯微鏡觀測蛋白表達情況，因此推薦共轉染的時候質粒和轉染試劑比例為1:4；

圖3 在HEK293T細胞中共轉染3μgGFP和mcherry，PEI-max和lipo3000對比圖；

圖4在HELA細胞中共轉染3μgGFP和mcherry，PEI-max和lipo3000對比圖；

圖5在HEK293T細胞中轉染500ng啟動子G的質粒和其激活蛋白質粒各1μg，轉染24h后檢測luciferase的活性；

圖6 在HEK293T細胞中各轉染2μgCRY2和SPA1質粒，24h后分別藍光處理1.5h，3.5h后做免疫共沉淀實驗。

具體實施方式

實施例1 轉染

（1）首先向離心管中加入150μLoptiMEM培養基，再個加入3μgGFP質粒，而后按照質粒（μg）：轉染試劑（μL）1:1.5、1:2、1:3、1:4、1:6加入PEI-max轉染試劑。并以商業化的轉染試劑lipofectamine 3000為對照進行參比。

（2）室溫孵育5min后加入到DMEM細胞培養液中；

（3）24-36h后進行檢測。

實驗結果如圖1所示，可見質粒與轉染試劑的比例在1：3:時轉染效果最佳。轉染效果接近商業化轉染試劑lipofectamine 3000。

實施例2 共轉染

共轉染質粒：GFP與mcherry質粒各1.5μg；具體轉染方案同實施例1。

實驗結果如圖2所示，從GFP和mCherry共轉染對比圖可以看出，三個轉染條件兩種蛋白均有大量的表達。

實施例3 蛋白共表達與商業化轉染試劑比較：