技術領域

本發明屬于動物細胞培養技術，涉及一種分選大鼠心成纖維細胞CD90⁺亞群的方法及其應用。

背景技術

缺血性心臟病已成為威脅人類健康和生命的頭號殺手，如何預防和治療缺血性心臟病引起了極大關注。目前，修復受損心肌主要是補充或替代壞死的心肌細胞，同時阻止心肌纖維化。近年來，隨著干細胞研究逐步深入，細胞移植被認為是一種極具臨床應用前景的治療缺血性心臟病的再生醫學療法。那么，除干細胞的定向修復外，可否調動心肌組織自身的、增殖能力較強的其他細胞，使其誘導分化為新的心肌細胞，從而使心功能得以有效改善，心成纖維細胞(Cardiac Fibroblasts, CFs)，數量巨大（占心肌組織細胞的60%），分布廣泛，且抗缺氧損傷能力強，即使在長期纖維化狀態下，仍具有較高的增殖和代謝活性，在心臟疾病發生、發展中起重要作用。

由于心肌細胞增殖能力有限，尤其是在心肌受到損傷時，心肌細胞增殖的速度難于迅速滿足恢復心功能的需要。越來越多的證據表明，誘導自體CFs向心肌細胞轉化則是修復受損心肌的最直接和最有效途徑之一。2006年，Takahashi和Yamanaka報道了將小鼠成纖維細胞，通過過表達四個關鍵轉錄因子Oct3/4，sox2，c-Myc和Klf4，可轉化為誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS）。2010年，Ieda等聯合三種心臟發育轉錄因子Gata4、Mef2C和Tbx5(GMT)，體外將成纖維細胞誘導轉化為心肌樣細胞。2012年，兩個不同研究團隊在體內也驗證了成纖維細胞可以直接重編程為心肌樣細胞，并且，Song等除了使用GMT外，還加入第四種轉錄因子Hand2，大大提高了心成纖維細胞向心肌樣細胞轉化的效率。Wada等嘗試Mesp1和Myocd，聯合GMT，也可使成纖維細胞向心肌樣細胞轉化。培養細胞微環境改變也可提高成纖維細胞重編程效率，Wada等將轉錄因子組合重編程的成纖維細胞與心肌細胞共培養，發現誘導的心肌樣細胞與原代培養心肌細胞間出現了同步收縮，表明可能在共培養的微環境中心肌細胞分泌的某些蛋白、細胞因子或者是電機械刺激促進了成纖維細胞的分化。前期研究發現，心肌急性梗死動物模型中，在梗死區和梗死邊緣區，CFs可以表達cTnT，表明微環境中的某些物質可在成纖維細胞向心肌樣細胞轉變中起決定作用。

已有研究表明，除小分子物質可以誘導成纖維細胞重編程為心肌細胞外，Deng等聯合用維生素A酸（Retinoic acie，RA），二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）和5-aza誘導人胎兒肝間充質干細胞（Human fetal liver-derived mesenchymal stem cells，HFMSCs）向心肌樣細胞轉化。有大量研究發現5-aza可誘導骨髓間充質干細胞（Bone marrow-derived MSCs, BMSCs）和臍血間充質干細胞（human umbilical cord-derived MSCs, hucMSCs）向心肌細胞分化。5-aza是一種DNA甲基化酶抑制劑，為胞嘧啶核苷的類似物，在DNA復制過程中可替代正常的胞嘧啶核苷酸形成新的DNA雙鏈，可與DNA甲基轉移酶共價結合，使酶活性降低，使細胞基因組DNA在復制中進行性去甲基化，激活表型特異的基因表達。也有研究證實，5-aza可使成纖維細胞向心肌細胞分化，湯成春等將體外培養CFs經5-aza誘導后，可檢測到β-MHC的表達，移植入心肌梗死區及其周圍區域，4 w后通過電鏡和免疫組化證實CFs轉化為心肌樣細胞。

前期研究發現，在心肌損傷情況下，大鼠CFs可以表達心肌特有的肌鈣蛋白（cTnT）和干細胞的標記物nanog。在體外培養狀態下，部分CFs既表達nanog、也表達c-kit和sca-1等多種心肌干細胞標記物，同時也表達CD73和CD90等間充質干細胞表面標記，體外定向誘導可使其向成心肌、成神經、成骨和成脂分化，提示CFs可能是由不同的干細胞亞群組成，具有高度的幼稚性，在一定的條件下具備分化為心肌樣細胞的潛能。因此，如果能將具有分化潛能的CFs轉化為心肌細胞，不但可以減少對心臟的不利影響（如瘢痕等），而且可以高效增加心肌細胞數量，改善心功能。

已有研究發現，CD90（Thy1）在其他組織成纖維細胞中也有表達，大鼠肺、心及人的眼眶和生殖道的成纖維細胞均可分為Thy1^-群和Thy1⁺群，在細胞增殖和膠原合成上有顯著差異，但CD90⁺ CFs在向心肌細胞分化中，及其細胞移植后對心肌損傷的修復作用，尚未見報道。