本發(fā)明公開了用于分離獲得肺臟干細(xì)胞的試劑盒及方法，其中肺臟干細(xì)胞分離試劑盒包含：組織消化液；經(jīng)過輻照處理的胚胎成纖維細(xì)胞；以及肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液。利用該試劑盒能夠有效獲得可以大量擴(kuò)增的肺臟干細(xì)胞，且獲得的肺臟干細(xì)胞活性好、純度高、無細(xì)菌和支原體污染。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及肺臟干細(xì)胞分離和移植技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于分離獲得肺臟干細(xì)胞的試劑盒及方法。

背景技術(shù)

隨著空氣污染的增加及病毒感染等其他一些因素，肺部的一些疾病如肺纖維化，慢性阻塞性肺病等越來越多的影響了人類的健康，甚至生存。對于這些疾病的治療，目前最有效的治療方法是肺臟移植。但是由于可用的供體有限，異體之間的免疫排斥等現(xiàn)實(shí)原因，能夠接受肺臟移植治療的病人數(shù)量非常稀少。除去肺臟移植，目前還沒有有效的治療手段。

肺臟干細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞，在機(jī)體內(nèi)分布廣泛，其在細(xì)胞移植治療中具有器官的靶向性，再生能力強(qiáng)，無成瘤性，可用于自體干細(xì)胞移植治療，免疫排斥的風(fēng)險小，具有很強(qiáng)的可操作性。并且，目前已有研究發(fā)現(xiàn)，將遠(yuǎn)端氣管中的肺臟干細(xì)胞分離出來，然后在體外大量擴(kuò)增后移植到免疫缺陷的肺部損傷的小鼠中，移植的肺臟干細(xì)胞能夠整合到小鼠肺臟中并在損傷部位形成肺泡樣的結(jié)構(gòu)。因而，干細(xì)胞移植在治療肺部損傷疾病方面具有非常廣闊的前景。但是，長期以來由于技術(shù)的限制，很難從成體的組織和器官中分離獲得可以大量擴(kuò)增的肺臟干細(xì)胞。

因而，目前的肺臟干細(xì)胞分離獲得方法仍有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種能夠有效從成體的組織和器官中分離獲得可以大量擴(kuò)增的肺臟干細(xì)胞的手段。

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種肺臟干細(xì)胞分離試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包含：組織消化液；經(jīng)過輻照處理的胚胎成纖維細(xì)胞；以及肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液，

其中，所述組織消化液包含：

99體積％的PBS；

0.1-2U/ml DNA酶；

0.1-0.2mg/ml I型膠原酶；

0.1-0.2mg/ml IV型膠原酶；

0.04-0.1mg/ml分散酶；

0.1-0.5mg/ml蛋白酶XIV；

0.1-3mg/ml鏈絲菌蛋白酶E；以及

0.2-0.5mg/ml胰酶，

所述肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液包含：

90體積％的RPMI1640培養(yǎng)基；

10體積％的胎牛血清；

1-3mmol/LL-谷氨酰胺；

0.05-0.15mmol/Lβ-巰基乙醇；

100-1000U/ml白血病抑制因子；以及

2-5ng/ml EGF生長因子。

發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的試劑盒能夠有效用于肺臟干細(xì)胞分離，具體地，利用其組織消化液能夠有效對包含肺臟干細(xì)胞的生物樣本進(jìn)行消化處理，獲得單細(xì)胞；利用肺臟干細(xì)胞分離培養(yǎng)液與單細(xì)胞混合，并置于經(jīng)過輻照處理的胚胎成纖維細(xì)胞上進(jìn)行孵育培養(yǎng)，能夠有效獲得可以大量擴(kuò)增的肺臟干細(xì)胞，且獲得的肺臟干細(xì)胞活性好、純度高、無細(xì)菌和支原體污染。此外，本發(fā)明的試劑盒成本低，使用方便，易于大量生產(chǎn)利用，并且尤其適用于從微量生物樣本中分離獲得肺臟干細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，通過下列任意一種方法制備獲得所述經(jīng)過增殖抑制處理的胚胎成纖維細(xì)胞：