技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種用于制備疫苗的豬偽狂犬病毒變異毒株，特別涉及一種豬偽狂犬病毒變異毒株TK、gE和gI基因缺失的毒株。

背景技術(shù)：

豬偽狂犬病是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一種豬的重要傳染病，主要臨床癥狀包括：新生仔豬中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、斷奶仔豬和育肥豬表現(xiàn)出呼吸道癥狀、妊娠母豬繁殖障礙，已經(jīng)給世界生豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失 ^[1-3]。目前，該病防控主要依靠疫苗免疫，美國與部分歐洲國家已宣布通過基因缺失疫苗免疫和凈化技術(shù)，根除了該病在家豬中的流行^[4]。近30年來，我國廣泛使用PRV基因缺失弱毒疫苗，該病得到有效控制并逐步凈化^[5-6]。但是，2011年以來，我國許多免疫PRV活疫苗的豬場再次暴發(fā)該病，主要表現(xiàn)為仔豬神經(jīng)癥狀及死亡，生長豬呼吸道癥狀，妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、弱仔等，對該病防控提出新挑戰(zhàn)。

gE基因在PRV入侵宿主神經(jīng)系統(tǒng)(包括三叉神經(jīng)節(jié)和嗅神經(jīng))的擴散發(fā)揮重要作用，是PRV主要毒力基因，同時也是病毒復(fù)制的非必須基因。gE與gI是以非共價鍵形式結(jié)合成gE/gI復(fù)合物。最新研究表明gE/gI復(fù)合物與病毒順軸突傳播相關(guān)。gE/gI基因的缺失并不影響病毒的增殖滴度。敲除PRV TK和gE會導(dǎo)致一些PRV毒株毒力的顯著下降，并可用于研制PRV弱毒活疫苗。

本發(fā)明選擇一種PRV變異強毒株ZJ01，成功構(gòu)建ZJ01株的感染性細(xì)菌人工染色體克隆，并獲得TK、gE和gI基因缺失毒株ZJ01ΔTK/gE/gI(簡稱ZJ01R)和ZJ01ΔgE/gI。體外連續(xù)傳代培養(yǎng)試驗證明，該兩個重組病毒的滴度和遺傳特性穩(wěn)定。仔豬接種該病毒后體溫平穩(wěn)，無組織損傷，接種7日后即產(chǎn)生較高的gB抗體，21日時能夠產(chǎn)生較高的中和抗體。以大劑量變異強毒株進行攻毒，對照組全部死亡，重組病毒ZJ01R免疫組豬不發(fā)生死亡，無體溫升高和組織病變，肺臟及腦組織中未檢測到病毒，證明該重組病毒對豬體具有良好的免疫保護效 果，且對豬體不產(chǎn)生病理損傷，是理想的基因缺失疫苗候選對象，為研制PRV新型疫苗奠定了重要基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明提供一種豬偽狂犬病毒變異株TK/gE/gI基因缺失毒株，其保藏編號為：CGMCC No.10397，分類命名：豬偽狂犬病毒，PRV-ZJ01R。本發(fā)明所述的毒株，結(jié)構(gòu)為ZJ01TK^-/gE^-/gI^-。

本發(fā)明所述的毒株，其中，ZJ01TK^-/gE^-/gI^-的DNA序列為將ZJ01序列去除序列表1-2的序列所述序列后所得序列。

本發(fā)明所述的毒株，其中，ZJ01的GeneBank DNA序列號為KM061380.1。

本發(fā)明所述的毒株，其中，TK的DNA序列為序列表1的序列。

本發(fā)明所述的毒株，其中，gE的DNA序列為序列表2的序列。

本發(fā)明所述的毒株，其中，gI的DNA序列為序列表2的序列。

序列表2的序列為gE/gI基因序列融合在一起的序列。

本發(fā)明所述的毒株，以PRV ZJ01株為原始毒株經(jīng)過基因結(jié)構(gòu)改造得到，其中PRV ZJ01株由本實驗室于2012年2月分離自浙江某規(guī)模豬場發(fā)病仔豬，屬高致病性毒株，為BHK-21細(xì)胞F8代適應(yīng)毒。本發(fā)明以PRV ZJ01毒株為親本構(gòu)建的毒株為TK、gE和gI基因缺失病毒，為BHK-21細(xì)胞F10代適應(yīng)毒。

本發(fā)明的毒株已經(jīng)保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為CGMCC No.10397，保藏日期2015年02月3日，分類命名：豬偽狂犬病毒，PRV-ZJ01R，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

本發(fā)明的病毒毒株，其制備方法的設(shè)計方案為：