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[發明專利]一種農桿菌介導的高效玉米骨干自交系遺傳轉化的方法在審

專利信息
申請號: 201610069994.1 申請日: 2016-02-01
公開(公告)號: CN105567730A 公開(公告)日: 2016-05-11
發明(設計)人: 賴錦盛;宋偉彬;趙海銘 申請(專利權)人: 中國農業大學
主分類號: C12N15/82 分類號: C12N15/82;A01H4/00
代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245 代理人: 關暢;何葉喧
地址: 100193 *** 國省代碼: 北京;11
權利要求書: 查看更多 說明書: 查看更多
摘要:
搜索關鍵詞: 一種 桿菌 高效 玉米 骨干 自交系 遺傳 轉化 方法
【權利要求書】:

1.一種玉米自交系遺傳轉化方法,包括如下步驟:

(1)將含有目的基因的重組表達載體導入農桿菌,得到重組農桿菌;

(2)取步驟(1)得到的重組農桿菌,對玉米自交系的外植體進行侵染;

(3)完成步驟(2)后,取所述外植體,置于共培養培養基,進行共培養;

(4)完成步驟(3)后,取所述外植體,置于恢復培養基Ⅰ,進行初次恢復培養;

(5)完成步驟(4)后,取所述外植體,依次在篩選培養基Ⅰ和篩選培養基Ⅱ上 進行培養,獲得抗性愈傷組織;

(6)完成步驟(5)后,取所述抗性愈傷組織,置于恢復培養基Ⅱ,進行二次恢 復培養;

(7)完成步驟(6)后,取所述抗性愈傷組織,置于分化培養基進行培養,獲得 幼苗;

(8)完成步驟(7)后,取所述幼苗置于生根培養基進行培養,獲得玉米自交系 轉化苗。

2.如權利要求1所述的方法,其特征在于:

每1L所述共培養培養基包括:MS鹽3.90~4.80g、煙酸1.2~1.4mg、VB10.23~ 0.28mg、VB60.23~0.28mg、泛酸鈣0.23~0.28mg、鹽酸硫胺0.45~0.55mg、蔗糖 27.0~33.0g、L-脯氨酸1.24~1.52g、2,4-D0.45~0.55mg、6-BA0.009~0.011mg、 植物凝膠3.15~3.85g和90~110μmol乙酰丁香酮,所述共培養培養基的溶劑為水, 所述共培養培養基的pH值為5.4~6.0;

每1L所述恢復培養基Ⅰ包括:MS鹽3.90~4.80g、煙酸1.2~1.4mg、VB10.23~ 0.28mg、VB60.23~0.28mg、泛酸鈣0.23~0.28mg、鹽酸硫胺0.45~0.55mg、蔗糖 27.0~33.0g、L-脯氨酸1.24~1.52g、2,4-D0.45~0.55mg、6-BA0.009~0.011mg、 植物凝膠3.15~3.85g、特美汀90~110mg和AgNO33.1~3.7mg,所述恢復培養基Ⅰ的溶 劑為水,所述恢復培養基Ⅰ的pH值為5.4~6.0;

每1L所述篩選培養基Ⅰ包括:MS鹽3.90~4.80g、煙酸1.2~1.4mg、VB10.23~ 0.28mg、VB60.23~0.28mg、泛酸鈣0.23~0.28mg、鹽酸硫胺0.45~0.55mg、蔗糖 27.0~33.0g、L-脯氨酸1.24~1.52g、2,4-D0.45~0.55mg、6-BA0.009~0.011mg、 植物凝膠3.15~3.85g、特美汀90~110mg、雙丙氨膦1.35~1.65mg和AgNO33.1~3.7mg, 所述篩選培養基Ⅰ的溶劑為水,所述篩選培養基Ⅰ的pH值為5.4~6.0;

每1L所述篩選培養基Ⅱ包括:MS鹽3.90~4.80g、煙酸1.2~1.4mg、VB10.23~ 0.28mg、VB60.23~0.28mg、泛酸鈣0.23~0.28mg、鹽酸硫胺0.45~0.55mg、蔗糖 27.0~33.0g、L-脯氨酸1.24~1.52g、2,4-D0.45~0.55mg、6-BA0.009~0.011mg、 植物凝膠3.15~3.85g、特美汀90~110mg、雙丙氨膦2.7~3.3mg和AgNO33.1~3.7mg, 所述篩選培養基Ⅱ的溶劑為水,所述篩選培養基Ⅱ的pH值為5.4~6.0;

每1L所述恢復培養基Ⅱ包括:MS鹽3.90~4.80g、煙酸1.2~1.4mg、VB10.23~ 0.28mg、VB60.23~0.28mg、泛酸鈣0.23~0.28mg、鹽酸硫胺0.45~0.55mg、蔗糖 27.0~33.0g、L-脯氨酸1.24~1.52g、6-BA3.15~3.85mg、毒莠定0.9~1.1mg、植 物凝膠3.15~3.85g、特美汀90~110mg和雙丙氨膦1.35~1.65mg,所述恢復培養基Ⅱ 的溶劑為水,所述恢復培養基Ⅱ的pH值為5.4~6.0;

每1L所述分化培養基包括a1)或a2):

a1)MS鹽3.90~4.80g、煙酸1.2~1.4mg、VB10.23~0.28mg、VB60.23~0.28mg、 泛酸鈣0.23~0.28mg、鹽酸硫胺0.45~0.55mg、蔗糖10~15g、葡萄糖15~20g、L- 脯氨酸0.63~0.77g、植物凝膠3.15~3.85g、酪蛋白水解物0.18~0.22g、甘氨酸 0.036~0.044g、肌醇0.09~0.11g和雙丙氨膦2.7~3.3mg,

a2)蔗糖27.0~33.0g、L-脯氨酸0.63~0.77g、植物凝膠3.15~3.85g、KNO32547~ 3113mg、(NH4)2SO4417~509mg、KH2PO4360~440mg、MgSO4·7H2O167~204mg、CaCl2·2H2O 149~183mg、MnSO4·H2O6.8~8.4mg、ZnSO4·7H2O1.8~2.2mg、H3BO32.7~3.3mg、 KI0.68~0.83mg、Na2MoO4·2H2O0.23~0.28mg、CuSO4·5H2O0.023~0.028mg、CoCl2·6H2O 0.023~0.028mg、乙二胺四乙酸鈉鐵鹽32.9~40.1mg、氯化膽堿0.088~0.108mg、 VB20.044~0.054mg、D-生物素0.09~0.11mg、煙酸0.18~0.22mg、葉酸0.0437~ 0.0534mg、VB10.425~0.519mg、D-泛酸鈣0.09~0.11mg、VB60.18~0.22mg、VB120.0014~0.0017mg、對氨基苯甲酸0.044~0.054mg、酪蛋白水解物0.18~0.22g、甘氨 酸0.036~0.044g、肌醇0.09~0.11g和雙丙氨膦2.7~3.3mg,

所述分化培養基的溶劑為水,所述分化培養基的pH值為5.5~6.1;

每1L所述生根培養基包括:MS鹽1.949~2.382g、蔗糖27.0~33.0g、植物凝膠 3.15~3.85g和雙丙氨膦2.7~3.3mg,所述生根培養基的溶劑為水,所述生根培養基 的pH值為5.4~6.0。

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