技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種重組PCGUR慢病毒干擾載體、 慢病毒，本發明還涉及一種重組PCGUR慢病毒干擾載體、慢病毒的構建方法 及應用。

背景技術

慢病毒(Lentivirus)是一種逆轉錄病毒，對分裂細胞和非分裂細胞均具有 感染能力，慢病毒目前可以在細胞或者體內實現長效的外源基因表達和基因沉 默。

微小RNA(microRNA，miRNA)是目前研究最多的一類內源性非編碼小 分子RNA，長度約為19-23nt，miRNA能夠在轉錄后水平上對基因的表達進行 負調控，導致mRNA的翻譯抑制或降解，抑制蛋白質的合成，產生基因沉默 效應。作為miRNA中的一員，mmu-miR-199b-5p是2003年由Lagos-Quintana 首先從鼠細胞克隆得到，隨著對其研究的不斷深入，mmu-miR-199b-5P基因在 子宮內膜癌、卵巢癌、子宮內膜異位癥等多種疾病中都有異常的表達。 mmu-miR-199b-5p通過影響細胞增殖、調亡、侵襲和血管形成，參與腫瘤形成 發展的各個階段。目前，miRNA在婦科常見疾病如子宮內膜癌、卵巢癌以及子 宮內膜異位癥中發揮作用的具體調控機制還不是十分清楚，但已有證據表明 miRNA參與調控其發生發展。隨著miRNA的深入研究，有望可能作為一種新 的腫瘤生物學標記物，對其在癌前病變以及惡性腫瘤中的特異表達進行檢測， 有助于對婦科惡性腫瘤的早期診斷，尤其有助于對那些早期無明顯臨床癥狀的 腫瘤患者進行篩選。

然而現有技術的缺點是，缺乏一種干擾mmu-miR-199b-5p基因表達的慢病 毒干擾載體。

發明內容

本發明的目的是提供一種重組PCGUR慢病毒干擾載體、慢病毒、構建方 法及應用，解決了現有技術中缺乏一種干擾mmu-miR-199b-5p基因表達的慢病 毒干擾載體的問題。

本發明的第一個目的是提供一種重組PCGUR慢病毒干擾載體，將購買的 慢病毒干擾載體PCGUR，經內切酶AgeI和內切酶EcoRI雙酶切后，得到一個 長序列片段和一個短序列片段，然后在所述長序列片段內，連入改造的 mmu-miR-199b-5p基因特異片段，得到重組PCGUR慢病毒干擾載體，所述改 造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段的正義鏈的核苷酸序列如SEQIDNO.3 所示，反義鏈的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。

本發明的第二個目的是提供一種重組PCGUR慢病毒干擾載體的構建方 法，具體按照以下步驟實施：

步驟1，獲得改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段

步驟1.1，化學合成改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段的正義鏈，其 核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；

化學合成改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段的反義鏈，其核苷酸序列 如SEQIDNO.4所示；

步驟1.2，將步驟1.1中獲得的正義鏈配置成正義鏈溶液，將步驟1.1中獲 得的反義鏈配置成反義鏈溶液，經退火反應，獲得改造的mmu-miR-199b-5p基 因特異片段；

步驟2，獲得重組PCGUR慢病毒干擾載體

步驟2.1，購買慢病毒干擾載體PCGUR，并利用內切酶AgeI和內切酶EcoRI 對慢病毒干擾載體PCGUR進行雙酶切，得到一個長序列片段和一個短序列片 段，然后將長序列片段進行回收，獲得慢病毒干擾載體PCGUR的長序列片段 產物；

步驟2.2，將步驟1.2中獲得的改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段和 步驟2.1中獲得的慢病毒干擾載體PCGUR的長序列片段產物，經T4DNA連 接酶連接，獲得連接產物，然后將所述連接產物回收，獲得重組PCGUR慢病 毒干擾載體。

優選的，所述步驟1中，獲得改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段，具 體按照一下步驟實施：

步驟1.1a，化學合成mmu-miR-199b-5p基因特異片段的正義鏈，其核苷酸 序列如SEQIDNO.1所示，并在其5’端添加核苷酸序列ccgg，在3’端添加核苷 酸序列ttttttg，形成改造的mmu-miR-199b-5p基因特異片段的正義鏈；