技術領域

本發明涉及一種檢測VEGF的新方法，尤其是通過外周血檢測腎癌患者 VEGF的方法。

背景技術

在腎癌的發生發展中，缺氧誘導信號通路發揮著重要的作用，其信號的改 變可以影響下游的VEGF通路，促進腫瘤血管生成，進而引起腫瘤進展。因此 VEGF不但可作為預后判斷的指標，也成為了腫瘤治療的新靶點。研究表明, VEGF可作為腎癌分期、分級及預后判斷的指標，為腎癌術后靶向藥物或細胞 因子輔助治療提供依據，目前，針對VEGF及其相關受體的靶向藥物，如索拉 非尼、蘋果酸舒尼替尼等，已成為晚期腎癌的一線治療用藥。因此，正確檢 測腎癌患者的VEGF表達情況至關重要。

目前通常使用的VEGF檢測方法有兩種。一種是免疫組織化學方法，通過 檢測腎癌組織標本中的VEGF相關蛋白表達情況判定VEGF狀態。另外一種方 法是蛋白免疫印跡法(Westernblot)，特異性更高，目前臨床應用亦越來越 多。這兩種檢測方法均是以腎癌組織為檢測對象，尤其適用于腎癌行手術切 除治療的患者。但對于部分缺乏手術指征或存在手術禁忌癥的腎癌患者(如 晚期腎癌患者)，由于腫瘤組織無法切除，細針穿刺組織又容易造成腫瘤播散， VEGF表達狀態的評估變得困難。

發明內容

循環腫瘤細胞(Circulatingtumorcell，CTC)是從實體腫瘤脫落進入 外周血液循環的腫瘤細胞，自1989年被發現以來，目前已有多種方法用于外 周血循環腫瘤細胞的檢測。近期研究表明，其檢測對于評估腫瘤患者尤其是 晚期腫瘤患者的預后以及選擇合適的個體化治療具有重要的臨床意義。因CTC 檢測具有微創、實時檢測等特點，被稱為腫瘤的“液態活檢”。

為了克服晚期腎癌患者不適宜組織標本取材，進而無法評估患者VEGF表 達狀態的不足，本發明提供了一種腎癌患者外周血VEGF的檢測方法：利用膜 過濾裝置分離獲取晚期腎癌患者外周血中的CTC；運用細胞蠟塊技術制作薄層 切片，進而檢測腎癌患者VEGF基因表達情況。

本發明采用的技術方案如下：

一、利用膜過濾裝置分離獲取晚期腎癌患者外周血中的CTC：

1、采集晚期腎癌患者外周血：肘正中靜脈5ml；

2、外周血樣預處理：將采集的外周血樣10倍稀釋，稀釋液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA,稀釋后加多聚甲醛固定外周血樣10分鐘，固定終濃度為 0.25％；

3、利用膜過濾分離腫瘤細胞裝置過濾外周血樣，分離獲得外周血循環腫 瘤細胞：將預處理的外周血樣加入到膜過濾分離腫瘤細胞裝置的血樣容器中， 使其依靠重力自然過濾；

4、過濾結束后，從膜過濾分離腫瘤細胞裝置中取下濾器，將循環腫瘤細 胞染色液加入到濾器中，染色2min，PBS緩沖液沖洗干凈，取下濾膜，放置 在載玻片上，干燥后在顯微鏡下觀察，確定CTC是否存在。

二、運用細胞蠟塊技術制作薄層切片：

1、脫色：將帶有CTC的濾膜從載玻片上取下，置于脫色液中浸泡4-6小 時，脫去CTC染色液，所述脫色液為：95％酒精與100％二甲苯按體積比1:1混 勻。

2、包裹：浸泡結束后取出濾膜，用用吸水紙包裹；

3、固定：將包裹物置于10％中性福爾馬林中，固定4-6h；

4、浸蠟包埋：固定結束后取出包裹物，脫水后置于石蠟包埋盒中，浸蠟 包埋制作細胞石蠟塊；

5、薄層切片：用切片機將細胞石蠟塊連續切片，制成厚度為4μm的薄 層切片。

三、檢測腎癌患者VEGF基因表達情況：

1、將CTC蠟塊薄層切片在染色缸中按以下步驟進行脫蠟和水化：二甲苯 溶液浸泡3次，每次10分鐘；無水乙醇溶液浸泡3次，每次5分鐘；95％乙 醇溶液浸泡5分鐘；85％乙醇溶液浸泡5分鐘；75％乙醇溶液浸泡5分鐘；蒸 餾水浸泡2次，每次3分鐘；PBS(PH＝7.4)浸泡3次，每次3分鐘；