技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體是涉及一種在蝴蝶蘭中表達(dá)的成花相關(guān)GIGANTEA基因(DhGI1)的克隆，該基因序列的分析，基因表達(dá)模式的分析，目的基因表達(dá)載體的構(gòu)建，植物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因植株的獲得以及相應(yīng)的生理特性的鑒定。

背景技術(shù)

蝴蝶蘭作為一種具有較好經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值的花卉深受?chē)?guó)內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛(ài)，但其成花需要電力降溫或高山催花，這就大大提高了其生產(chǎn)成本。因此，很多學(xué)者就嘗試通過(guò)基因工程手段調(diào)控蝴蝶蘭花期，以降低生產(chǎn)成本。韓穎穎等(2004、2005)在蝴蝶蘭花瓣中得到了查爾酮合酶cDNA(pchs)，并成功轉(zhuǎn)化煙草證明其參與花的形態(tài)建成。Zhang等(2010)在Phalaenopsishybrida(cv.weddingpromenade)中成功分離得到FLORICAULA/LEAFY(FLO/LFY)的同源基因PhalLFY，通過(guò)半定量RT-PCR得出PhalLFY是蝴蝶蘭成花的關(guān)鍵基因。轉(zhuǎn)基因方面的研究也取得了一定的進(jìn)展，Belarmino等(2000)首先成功報(bào)道了用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法開(kāi)展蝴蝶蘭轉(zhuǎn)基因；Mishiba等(2005)用未成熟的圓球莖與農(nóng)桿菌(包含gus和潮霉素抗性基因)共培養(yǎng)，在篩選培養(yǎng)基上(含20mg/L的潮霉素)PLB再生獲得蝴蝶蘭抗潮霉素的抗性植株；Qin等(2010)用葉片誘導(dǎo)出的愈傷組織與含有抗冷基因LTP的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，得到了大量的抗冷蝴蝶蘭轉(zhuǎn)基因植株。但是，有關(guān)蝴蝶蘭GIGANTEA基因(DhGI1)的研究還尚未見(jiàn)報(bào)道。

目前GI基因及同源基因功能分析主要集中在如擬南芥、金魚(yú)草等長(zhǎng)日照植物和水稻、菊花等短日照植物上，研究表明GI基因在不同物種中的功能差異很大，有時(shí)甚至相反，如在擬南芥GI基因的表達(dá)是促進(jìn)開(kāi)花，而在水稻則抑制開(kāi)花。目前GI基因在光期鈍感植物的生物學(xué)功能研究尚未見(jiàn)報(bào)道，對(duì)開(kāi)花具體調(diào)控機(jī)理尚不清楚。

本發(fā)明研究了一種從蝴蝶蘭中克隆出來(lái)的與成花相關(guān)GIGANTEA基因(DhGI1)，轉(zhuǎn)入擬南芥后引起花期提早。而在本發(fā)明公布之前尚未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道過(guò)蝴蝶蘭成花相關(guān)GIGANTEA基因(DhGI1)的核苷酸序列及其在轉(zhuǎn)基因植株中應(yīng)用的資料。本申請(qǐng)?zhí)矫髁薌I基因在光期鈍感植物的生物學(xué)功能，通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)摸索了一套光周期頓感植物誘導(dǎo)其成花方法。同時(shí)，理論上還揭示了蝴蝶蘭成花"溫敏"現(xiàn)象的分子機(jī)理。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種從蝴蝶蘭中克隆出來(lái)的與成花相關(guān)的GIGANTEA基因，以及利用該基因在調(diào)控植物花期上的應(yīng)用。

解決上述技術(shù)問(wèn)題采用如下技術(shù)方案：

本蝴蝶蘭成花相關(guān)GIGANTEA基因(DhGI1)為具有特定序列的DNA分子，編碼區(qū)全長(zhǎng)4022bp，包含一個(gè)3483bp的開(kāi)放閱讀框，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。

本蝴蝶蘭成花相關(guān)GIGANTEA基因(DhGI1)編碼的蛋白質(zhì)分子，具有SEQIDNO.2所示的氨基酸編碼序列。

本蝴蝶蘭成花相關(guān)GIGANTEA基因(DhGI1)的核苷酸引物序列，保守區(qū)設(shè)計(jì)的一系列的RACE引物和RT-PCR引物序列見(jiàn)表1和表2。

表1.通用引物

表2.RACE特異性引物和RT-PCR引物

本蝴蝶蘭成花相關(guān)GIGANTEA基因(DhGI1)的核苷酸編碼序列SEQIDNO.1轉(zhuǎn)入擬南芥以改變開(kāi)花時(shí)間的方法按如下步驟進(jìn)行：

(1)將蝴蝶蘭GIGANTEA基因(DhGI1)的開(kāi)放閱讀框連接入植物表達(dá)載體，形成含有蝴蝶蘭DhGI1基因的植物表達(dá)載體；

(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，用含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液浸泡擬南芥花序，收集轉(zhuǎn)基因種子；

(3)通過(guò)對(duì)擬南芥種子抗生素篩選和PCR鑒定，獲得再生轉(zhuǎn)基因植株，開(kāi)花時(shí)間比野生型擬南芥提早。

本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)樣品中是否存在蝴蝶蘭DhGI1基因的核苷酸序列SEQIDNO.1的方法，使用SEQIDNO.4的核苷酸序列(見(jiàn)表3)對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后電泳檢測(cè)目的片段的有無(wú)。

表3.驗(yàn)證用引物序列