技術(shù)領(lǐng)域

一種在生物合成法生產(chǎn)順式-3-羥基-L-脯氨酸的系統(tǒng)中有效提高脯氨酸轉(zhuǎn)化率 的方法，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

羥脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)為亞氨基酸，是脯氨酸羥基化后的產(chǎn)物，根據(jù)其 羥基化位置的不同，可分為3-羥脯氨酸(3-Hyp)或4-羥脯氨酸(4-Hyp)。自然界中反式-4-羥 脯氨酸較為常見，順式-3-羥基-L-脯氨酸是動物組織蛋白如膠原等的重要組成部分。順式- 3-羥基-L-脯氨酸廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、營養(yǎng)和美容業(yè)等方面。

目前，國內(nèi)外生產(chǎn)羥脯氨酸的方法主要有3種：水解法，化學合成法以及生物合成 法。水解法主要用于提取動物骨膠原中的反式-4-羥脯氨酸[16]，由于順式-3-羥脯氨酸在 骨膠原中含量極少，因而無法通過常見的水解法獲得。已有的研究報道中，獲取順式-3-羥 脯氨酸的方法主要是化學合成法和微生物轉(zhuǎn)化法。

生物合成法能將游離的脯氨酸通過脯氨酸-3-羥化酶的催化，轉(zhuǎn)化為順式-3-羥 基-L-脯氨酸，但在生物細胞中，游離的脯氨酸也是一種可以被利用的碳源，所以有必要打 斷生物細胞的脯氨酸降解途徑，以阻止菌體降解脯氨酸。

本發(fā)明所提供的使含有重組DNA的順式-3-羥脯氨酸生物合成系統(tǒng)活性增強的方 法，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容

針對生物合成法生產(chǎn)順式-3-羥基-L-脯氨酸時，需降解脯氨酸會限制順式-3-羥 脯氨酸合成等缺點，本發(fā)明的目的是提供一種在生物合成法生產(chǎn)順式-3-羥基-L-脯氨酸的 系統(tǒng)中能夠有效提高脯氨酸轉(zhuǎn)化率的方法。

本發(fā)明是一種在生物合成法生產(chǎn)順式-3-羥基-L-脯氨酸的系統(tǒng)中有效提高脯氨 酸轉(zhuǎn)化率的方法。其特征是：在利用生物細胞生產(chǎn)順式-3-羥基-L-脯氨酸的過程中，通過打 斷生物細胞內(nèi)的脯氨酸降解途徑來提高脯氨酸的有效轉(zhuǎn)化率及順式-3-羥基-L-脯氨酸的 產(chǎn)量。

本發(fā)明所述重組細胞的構(gòu)建方法：

1.含有脯氨酸-3-羥化酶基因的載體的構(gòu)建

根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性，利用密碼子的簡并性在不改變氨基酸序列的基礎(chǔ) 上，消除低使用率的密碼子，優(yōu)化脯氨酸-3-羥化酶基因，使得其更有利于在大腸桿菌中得 到表達。同時，選用色氨酸串聯(lián)啟動子作為其啟動子，對其進行優(yōu)化，使得羥化酶基因得到 更為高效的表達。

2.通過敲除基因putA打斷細胞內(nèi)的脯氨酸降解途徑

putA(EC:1.5.99.81.5.1.12)基因編碼的蛋白PutA同時具有脯氨酸脫氫酶 (PRODH)和Δ-吡咯啉-5-羧酸脫氫酶(P5C)兩個催化區(qū)域，從而將脯氨酸氧化為谷氨酸。首 先，通過PRODH的作用，脯氨酸被氧化為吡咯啉-5-羧酸(P5C)同時耦合著輔酶Q的還原，之 后，P5C與水自發(fā)反應(yīng)生成谷氨酸-γ-半醛，再在Δ-吡咯啉-5-羧酸脫氫酶的催化作用下， 轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼帷Ｍ瑫rPutA蛋白也是一種多功能的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，在脯氨酸供應(yīng)不足的情 況下會作為轉(zhuǎn)錄阻遏子從而阻遏基因putA和putP(表達的PutP是主要的脯氨酸轉(zhuǎn)運體)的 表達。

敲除putA基因，可以有效的打斷細胞內(nèi)由L-脯氨酸降解為谷氨酸的過程，從而積 累更多的L-脯氨酸，有利于羥脯氨酸的產(chǎn)生。

3.重組大腸桿菌的發(fā)酵實驗

35℃、220rpm培養(yǎng)24h，包括BL21(DE3)△putA(pET21a-ptrp2-H3p)，取發(fā)酵液測定 順式-3-羥脯氨酸的含量。

附圖說明

圖1.順式-3-羥脯氨酸在大腸桿菌細胞中的生物轉(zhuǎn)化途徑。

圖2.色氨酸啟動子質(zhì)粒圖譜。

圖3.表達質(zhì)粒pET21a-ptrp2-H3p圖譜。

具體實施方式

LB培養(yǎng)基:1％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母抽提物，1％(W/V)NaCl，pH7.0- 7.2。

Amp(Kan)抗性平板：1％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母抽提物，1％(W/V)NaCl， 1.5％(W/V)瓊脂糖，氨芐青霉素(卡那霉素)50μg/mL。