技術領域

本發明屬生物技術領域，具體涉及檢測E種腸道病毒的免疫熒光試劑及其檢測試 劑盒，適于E種腸道病毒感染的診斷及組織或細胞中牛腸道病毒抗原的定位與鑒定。

背景技術

牛腸道病毒（Bovineenterovirus,BEV）包括E、F兩個病毒種，屬于小RNA病毒科 腸道病毒屬中的成員，它所引起的傳染病給養牛業造成嚴重經濟損失。該病毒感染以臨床 上發熱、流淚、咳嗽、流鼻涕、呼吸困難和嚴重腹瀉為主要特征。本病于上世紀50年代后期由 Moll等首次報道，之后許多國家也相繼報道本病的發生。國內李英利等于2011年從內蒙某 奶牛場的犢牛糞便樣品中分離到一株F種腸道病毒。申請人從吉林省暴發的臨床上以呼吸 道和消化道癥狀為主要特征的疫病中，分離鑒定出一種新的腸道病毒：E種腸道病毒。E種腸 道病毒感染在國內為新發傳染病，嚴重危害養牛業的健康發展，其診斷與防治缺乏研究。

發明內容

本發明提供一種檢測E種腸道病毒的免疫熒光試劑及其檢測試劑盒。

檢測E種腸道病毒的免疫熒光試劑，是用FITC標記的VP1單克隆抗體。所述的VP1單 克隆抗體，是利用E種腸道病毒的VP1蛋白，采用雜交瘤單抗制備技術獲得；

所述的VP1蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。

所述的VP1蛋白為是由堿基序列如序列表SEQIDNO.1所示的E種腸道病毒基因 VP1表達的。

所述的E種腸道病毒基因VP1為人工合成。

E種腸道病毒直接免疫熒光檢測試劑盒，免疫熒光試劑為上述檢測E種腸道病毒的 免疫熒光試劑。

本發明提供了檢測E種腸道病毒的免疫熒光試劑及其檢測試劑盒，是應用本發明 的檢測E種腸道病毒的免疫熒光試劑，試劑建立的直接免疫熒光檢測方法，既可用于臨床快 速診斷E種腸道病毒感染，也可用于E種腸道病毒抗原在組織中的定位與鑒定。直接免疫熒 光檢測時間短，40分鐘內即可報告結果；特異性強，僅與E種腸道病毒反應；重復性好，準確 性高，與間接免疫熒光方法的符合率為90%以上，可用于E種腸道病毒感染的快速診斷。

本發明的優點

1、應用本發明試劑建立的直接免疫熒光方法，可用于臨床快速診斷E種腸道病毒感染， 也可用于E種腸道病毒抗原在組織細胞中的定位與鑒定；

2、直接免疫熒光方法特異性強、靈敏度高、具有很好的重復性。40分鐘內報告結果，可 用于E種腸道病毒的快速診斷；

3、具有生物安全性,試劑盒所用的抗E種腸道病毒VP1的單克隆抗體為原核載體表達的 重組蛋白誘導BALB/c小鼠產生，不含活的腸道病毒，因此不存在散毒危險；

4、敏感性高。制備單克隆抗體具有很高的免疫效價，從而確保異硫氰酸熒光素(FITC) 標記后試劑的敏感性；

5、特異性強。制備的免疫熒光試劑與其他病原體無交叉反應，只檢出E種腸道病毒，具 有很高特異性；

6、穩定性好,熒光試劑4℃保存6個月，檢測結果與常規方法無明顯差異，具有很好的穩 定性。

附圖說明

圖1pGEX-4T-1-VP1重組質粒酶切鑒定（泳道2、3：pGEX-4T-1-VP1；泳道1：pGEX- 4T-1質粒陰性對照；泳道4：DNA分子marker）；

圖2重組VP1蛋白的SDS-PAGE檢測結果（泳道3：pGEX-4T-1-VP1重組菌未誘導總蛋白； 泳道2：pGEX-4T-1-VP1重組菌誘導后總蛋白；泳道1：蛋白分子marker）；

圖3純化重組VP1蛋白的SDS-PAGE檢測結果；

圖4雜交瘤細胞染色體計數；

圖5直接免疫熒光檢測結果。

具體實施方式

實施例1E種腸道病毒結構蛋白VP1原核表達重組質粒的構建

1、引物設計

根據目標序列的堿基組成，分別設計引物擴增VP1基因的引物，上下游分別含有BamHI、 EcoRI酶切位點。引物序列如下：

E-VP1-FCGCGGATCCGAAACAAGCGTGGAGA（BamHI）

E-VP1-RCCGGAATTCGTACGAGGTGAGGCT（EcoRI）

2、基因擴增