本發明公開了重組腺病毒疫苗株高適應性HEK293克隆細胞株及其應用，屬于HEK293克隆細胞株領域。本發明采用有限稀釋法進行HEK293單細胞克隆，通過亞克隆，最終篩選獲得2株性能優異的單克隆細胞株，其微生物保藏編號分別為：CGMCC No.11096和CGMCC No.11097。本發明提供的兩株HEK293單克隆細胞株與母本細胞相比，其生長速度顯著加快，能夠更好地增殖重組腺病毒rAdV?SFV?E2株，并顯著提高病毒的復制水平，穩定性更好。應用本發明的兩株HEK293單克隆細胞株增殖重組腺病毒rAdV?SFV?E2株，可獲得較高效價的病毒液，病毒滴度提升顯著。

技術領域

本發明涉及克隆細胞株，尤其涉及HEK293克隆細胞株，本發明還涉及所述HEK293克隆細胞株在培養重組腺病毒rAdV-SFV-E2株中的應用，屬于HEK293細胞的克隆和應用領域。

背景技術

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是危害養豬業最嚴重的傳染病之一，被世界動物衛生組織(OIE)列為OIE動物疫病名錄，中國將其列為一類傳染病。自20世紀50年代末推廣使用豬瘟兔化弱毒疫苗以來，有效地控制了CSF在中國大面積爆發和流行。但近幾年，中國豬瘟的發病率又呈上升趨勢，其流行特點也發生了重大改變，以溫和型豬瘟和母豬持續感染所引起的流產、死胎和新生仔豬死亡等為主，給養豬業造成了嚴重的經濟損失。豬瘟兔化弱毒疫苗存在一些不足，給該病的凈化及根除帶來了許多困難。首先，現行豬瘟弱毒疫苗的生產工藝存在較多問題，用于生產疫苗的犢牛睪丸細胞和犢牛血清經常污染BVDV或其抗體，嚴重影響豬瘟疫苗的效價和質量；其次，弱毒疫苗接種時受豬瘟母源抗體干擾，如果免疫程序不當，容易造成免疫失敗、先天性感染、隱性感染或免疫耐受。因此，研究一種安全有效的新型豬瘟疫苗是當務之急。

以活病毒為載體的疫苗，可誘導機體產生針對目的抗原的免疫應答，是一種極具開發前景的新型疫苗。重組腺病毒可模仿病毒天然的感染方式，并直接在體內表達天然的、具有生物活性的抗原蛋白，能誘導機體產生有效的特異性體液免疫和細胞免疫應答。近年來，以重組腺病毒作為載體攜帶外源基因的新型疫苗研究越來越受到人們的關注。由本發明人所在團隊研制的腺病毒/甲病毒復制子嵌合載體豬瘟基因工程疫苗rAdV-SFV-E2株，結合了腺病毒載體高效遞送和甲病毒復制子載體高效表達外源基因的功能。該疫苗株高度安全，且免疫效力與豬瘟兔化弱毒疫苗C株相當，并克服了C株疫苗的一些缺陷，如生產工藝、母源抗體干擾、不同疫苗免疫時相互干擾等。

由于復制缺陷型重組腺病毒的增殖需要在可反式提供缺失蛋白的HEK293細胞進行包裝，依靠細胞的生長增殖病毒。

因此，從HEK293母本細胞株中篩選獲得重組腺病毒rAdV-SFV-E2株高適應性的HEK293克隆細胞株，對豬瘟基因工程疫苗開發和生產均具有重要的意義。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是從HEK293母本細胞株中克隆得到能夠高效培養重組腺病毒rAdV-SFV-E2株并顯著提高病毒滴度的HEK293克隆細胞株。

為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案是：

本發明選擇種細胞HEK293，采用有限稀釋法進行單細胞克隆，然后選取單個克隆進一步亞克隆，經2次亞克隆，最終獲得4株單克隆細胞株，分別命名為HEK293-D9、HEK293-B8、HEK293-D10和HEK293-C4。

本發明進一步對HEK293克隆細胞株HEK293-D9、HEK293-B8、HEK293-D10和HEK293-C4的形態和生長特性進一步研究，并分析其對重組腺病毒rAdV-SFV-E2株的適應性。

生長特性實驗結果顯示，單細胞克隆株HEK293-D9和HEK293-B8的生長速度明顯快于其它兩株細胞及母本細胞。