技術領域

本發明涉及一種紅麻根結線蟲分離鑒定方法，屬于微生物技術領域。

背景技術

紅麻(kenaf)為錦葵科木槿屬一年生纖維作物，是世界上僅次于棉花的第二大天然纖維作物之一，廣泛栽培于印度、孟加拉、中國、泰國等國家。紅麻纖維具有產量高、吸濕性強、散熱性好、易降解等優良特性，因此引起了世界各國的重視。近年來，其作為造紙、紡織及生物質能、麻塑、麻碳的優良原料而備受企業關注。

隨著研究的不斷深入，紅麻被廣泛應用于紡織、建筑、家居、汽車工業等各個領域。為了滿足人們對于天然纖維需求的增長，紅麻的種植面積也在逐年遞增，但是由于旱作物和人為重茬，以及育種單位很少涉及抗根結線蟲病的育種選擇，使得紅麻根結線蟲病害逐漸加重，降低了紅麻的產量與纖維品質。紅麻根結線蟲病成為了影響我國紅麻生產的主要病害，它在全國麻區普遍發生，尤其在溫暖濕潤的地區發病尤為嚴重。通過調查發現，根結線蟲主要危害紅麻根部，形成根結、根瘤，進而直接影響到紅麻的產量與品質，成為國內外紅麻生產推廣的一大瓶頸。本技術方法通過對紅麻根結線蟲不同種群進行分離、純化和鑒定，可以明確紅麻根結線蟲的形態和種類，從而為紅麻根結線蟲病的研究與防治提供理論依據和科學的技術方法。

發明內容

本發明的目的在于對生產上根結線蟲發生動態變化提供一種簡便、快速、準確的紅麻根結線蟲分離鑒定方法。對紅麻根結線蟲進行分離、純化和鑒定并提供后續防控利用，提供鑒定和明確紅麻根結線蟲的形態、性質和種類，為紅麻根結線蟲的研究和防治提供科學依據，對紅麻抗病蟲新品種的選育和紅麻生產水平的提高具有重要意義。本發明集紅麻根結線蟲分離、純化和鑒定為一體，分離的病蟲純度高，可為紅麻根結線蟲的分離鑒定提供效率高、準確性強的技術方法。

本發明的目的通過如下技術方案實現：

一種紅麻根結線蟲分離鑒定方法，所述的黃紅麻根結線蟲分離鑒定方法具有分離的病蟲純度高、準確性強、效率高等優點，可用于紅麻田間根結線蟲病樣本的及時分離鑒定和后續防控應用。技術流程由取樣、培養純化、會陰花紋形態觀察、同工酶電泳分析和線粒體DNA擴增而成。

所述的一種紅麻根結線蟲分離鑒定方法按如下步驟進行：

（1）形態學鑒定：選取典型紅麻根結線蟲病病株，采用五點取樣法采集寄主根系及周圍5-20cm深的耕作層土壤500g。溫室條件下將病根和病土接種到預先用滅菌土培植45d的盆栽番茄上進行純化培養；在體視顯微鏡下，用解剖針從接種發病的番茄根中，挑取雌蟲和卵塊，將卵塊放于盛有蒸餾水的培養皿中孵化4-5d即可得到根結線蟲，用貝曼漏斗法分離土壤中的雄蟲；獲得蟲體后，制作線蟲玻片進行會陰花紋的形態鑒定；

（2）同工酶分析鑒定：運用常規聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，對純化的根結線蟲樣本進行酯酶和蘋果酸脫氫酶電泳分析。挑取20頭雌蟲于1.5ml離心管中研磨提取酶樣品，取20μL樣品加入聚丙烯酰胺膠孔中，以爪哇根結線蟲為對照進行電泳（60V1.5h;80V3.0h）。待電泳結束后，取出膠片，用蒸餾水清洗兩次，加入MDH染色液于暗室內進行蘋果酸脫氫酶染色20min，用蒸餾水漂洗后加入酯酶染色液(EST染色液)，于37℃水浴30min，完全顯色后用蒸餾水漂洗3次，于固定液中固定2h后，用蒸餾水漂洗，拍照；

（3）分子生物學鑒定：分別以純化后的根結線蟲種群為樣本，采用SDS法提取其DNA，以引物5-GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG-3和5-TACCTTTGACCAATCACGCT-3進行PCR，擴增其位于線粒體DNA中的COll基因和lrRNA基因。反應體系為：0.25μLTaq，2.5μL10×Buffer,2μLdNTPMixture,引物各1μL，1.0ng模板，加水至25μL。擴增條件為：94℃預變性5min，94℃變性1min，51℃退火1min，72℃延伸2min,35個循環，72℃延伸10min。電泳、回收純化并測序，然后將序列進行比對分析鑒定。

本發明的顯著優點：與其它病蟲分離方法相比，本發明提供的方法具有以下顯著優點：集紅麻根結線蟲分離、純化與鑒定為一體，分離病蟲的效率高、準確性強；弱化了紅麻根結線蟲中其他病蟲的干擾，分離病蟲的純度高，操作程序十分簡便；適用于紅麻田間根結線蟲病樣本的及時分離，保持了病蟲野生型特性。總之，本發明提供的方法具有操作簡單、效率高、準確性強等科學技術優點，是紅麻根結線蟲準確分離、純化和鑒定的有效方法，在紅麻根結線蟲的分離鑒定研究上具有重要的應用價值和科學意義。

附圖說明