技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及分子定量分析草珊瑚與3種混淆品的特異性引物及方法，具體為一種鑒別草珊瑚Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai ，金粟蘭Chloranthus spicatus,及己Chloranthus serratus，與寬葉金粟蘭Chloranthus henryi的分子定量分析的特異性標記引物，以及一種利用該特異性引物對草珊瑚與金粟蘭，及己和寬葉金粟蘭等3種混合品快速定量分析方法。

背景技術

草珊瑚Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai，俗稱腫節(jié)風，通常用于治療花斑癬、紫癜、風濕性關節(jié)痛、外傷?，F代研究表明有治療癌癥、抗腫瘤、抗炎、抗病毒和非特異性免疫增強上等藥理作用。然而，野生植物種質資源近年來已經減少，由于金粟蘭，寬葉金粟蘭、及己外形與草珊瑚極其相似，很容易與草珊瑚相混淆。但是他們有不同的屬性和藥用價值，這些易混植物也都有相應的肝毒性作用，及己在嚴重肝毒性病例報告和動物的毒性研究中已經證實有顯著肝毒性，這限制了它在臨床上的應用。

雖然草珊瑚新鮮葉片可以通過靜脈、附屬物和葉的非腺毛維管束結構之間的顯微鑒定差異從其混淆品中鑒別出來，但是粉末或粉碎片形式的草珊瑚和易混植物通過形態(tài)學和組織學技術是很難識別的。在過去的幾年中，利用化學分析技術如TLC、HPLC 、MS等識別草珊瑚及其相關制劑已經有所記載。雖然這些方法在某種程度上可以補充形態(tài)學或組織學鑒定的局限性，但化學指紋圖譜只能檢測部分化合物，只能提供有限的物種組成信息，不能給我們提供完全鑒別出草珊瑚的方法，而且很難進行定量分析，特別是在和它極為相似的物種相互混雜時。因此，建立草珊瑚與金粟蘭、及己和寬葉金粟蘭等產品混合時進行定量分析方法，比便對其相關產品對監(jiān)測質量至關重要。

隨著分子生物學的發(fā)展，DNA分子標記如RAPD、ISSR和SSR等分子標記， ITS（Internal transcribed spacer）等DNA條形碼技術提供了可靠的識別藥材的方法。然而，這些基于基因組DNA的分子標記技術容易受到基因組DNA降解的影響，由于核基因組DNA比葉綠體DNA拷貝數少，在加工過的藥材中更容易遭破壞而導致無法通過其分子標記技術進行鑒別。葉綠體DNA trnL-F區(qū)域的包含trnL（UAA）內含子和間隔，即trnL（UAA）- trnF（GAA）區(qū)作為DNA條形碼，它可以很容易利用通用引物進行擴增，這一序列已被證明可用于對多種植物在種水平的識別，被廣泛用于植物產品的檢測。

本課題組在前期研究中也發(fā)現，對于干燥或經加工過的藥材，基于葉綠體DNA trnL-F區(qū)域的鑒別技術比基于核基因組DNA的分子標記技術更為穩(wěn)定有效。本研究對草珊瑚、金粟蘭、寬葉金粟蘭和及己的 trnL-F區(qū)序列進行測序，分析其序列結構和特征，尋找單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphism SNP)分子標記，設計分別識別草珊瑚，金粟蘭、寬葉金粟蘭和及己的特異識別引物，建立多重PCR技術，鑒定引物的特異性，在此基礎上，利用這些特異引物對，構建實時熒光定量PCR,可快速簡單定量分析草珊瑚與金粟蘭、寬葉金粟蘭和及己3種混淆品的方法。本發(fā)明為草珊瑚與3個混淆種的分子定量分析提供了技術支持，對相關中藥飲片進行定量分析具有非常重要的意義，檢索未見草珊瑚與金粟蘭、寬葉金粟蘭和及己等3種混淆品的分子定量的發(fā)明專利申請。

發(fā)明內容

本發(fā)明的主要目的是提供一種可準確，快速，簡單定量分析草珊瑚與金粟蘭、寬葉金粟蘭和及己3種混淆品的技術，為相關草珊瑚飲片與這3種混淆品的混合品定量分析提供技術支持。

為實現上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

分子定量分析草珊瑚與3種混淆品的的特異性引物，特異識別草珊瑚的上游特異性引物SgF：5’- TGATTCTGATAGATT-TTTGAAGAATTGA - 3’與下游引物trnL-Fb：5’- GGGACTTGAACCCTCACGATT- 3’；同時特異性識別金粟蘭、及己和寬葉金粟蘭的特異上游引物ChF：5’- ATCTGATCACCCTTACACTTACAAGC - 3’與下游引物trnL-Ff：5’- ATT TGA ACT GGT GAC ACG AG - 3’。

分子定量分析草珊瑚與3種混淆品的方法，構建熒光定量PCR進行40個循環(huán)，反應體系