技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一株產(chǎn)生抗破傷風(fēng)類毒素特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株、其單克隆抗體和在吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗和偶聯(lián)疫苗研發(fā)和質(zhì)量控制上的應(yīng)用。

發(fā)明背景

破傷風(fēng)是一種由破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌(clostridium?tetani)引起的高度致死性疾病，主要發(fā)生于發(fā)展中國(guó)家，全世界每年死亡80至100萬(wàn)人，其中新生嬰兒破傷風(fēng)死亡50萬(wàn)人。破傷風(fēng)的預(yù)防主要通過(guò)主動(dòng)免疫(破傷風(fēng)疫苗)或被動(dòng)免疫(破傷風(fēng)特異性免疫球蛋白)實(shí)現(xiàn)。破傷風(fēng)疫苗由破傷風(fēng)類毒素(tetanus?toxoid，TT)制成，TT是一種經(jīng)過(guò)脫毒處理的類毒素，接種后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體。已上市的包含破傷風(fēng)類毒素組分的疫苗主要有單價(jià)破傷風(fēng)疫苗，百日咳-白喉-破傷風(fēng)聯(lián)合疫苗多聯(lián)疫苗。另外，破傷風(fēng)類毒素作為應(yīng)用最廣泛的載體蛋白被用于b型流感嗜血桿菌偶聯(lián)疫苗、流腦多糖蛋白偶聯(lián)疫苗、肺炎多糖蛋白偶聯(lián)疫苗中，預(yù)防嬰幼兒多發(fā)的流行性腦膜炎、肺炎等疾病。以解決因嬰幼兒的免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，單純的多糖抗原難以激發(fā)其產(chǎn)生足夠的抗體免疫反應(yīng)的不足。

無(wú)論是破傷風(fēng)疫苗、百白破聯(lián)合疫苗還是以破傷風(fēng)類毒素作為載體蛋白的多糖蛋白偶聯(lián)疫苗，在其研究和生產(chǎn)過(guò)程中，均需要準(zhǔn)確測(cè)定破傷風(fēng)類毒素蛋白的含量，用于指導(dǎo)工藝開發(fā)和疫苗質(zhì)量控制。在現(xiàn)行的2010版藥典中,此關(guān)鍵指標(biāo)測(cè)定主要依賴于蛋白含量測(cè)定方法(Lowry法)和絮狀單位測(cè)定法。Lowry法是一種常用的蛋白濃度檢測(cè)法，僅能測(cè)定樣品中總蛋白的含量，對(duì)于成分復(fù)雜的樣品不能準(zhǔn)確區(qū)分出破傷風(fēng)類毒素蛋白和準(zhǔn)確反映蛋白的抗原性，且操作相對(duì)復(fù)雜，檢測(cè)結(jié)果受實(shí)驗(yàn)操作的影響較大，對(duì)溶液配制等有較高的要求，還會(huì)受到多種離子的干擾，難以做到高通量，檢測(cè)靈敏度一般為微克(μg)級(jí)。而絮狀單位測(cè)定法雖部分解決了待測(cè)樣品抗原性測(cè)定的不足，但絮狀單位測(cè)定法以Lf單位濃度為標(biāo)準(zhǔn)。Lf單位是一個(gè)相對(duì)的效價(jià)單位，而非質(zhì)量單位且屬于半定量測(cè)定方法，人為因素對(duì)結(jié)果的判定干擾較大，檢測(cè)靈敏度也為微克(μg)級(jí)。同時(shí)，此方法中待測(cè)樣品中可能存在的其它抗體也會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，這給疫苗研發(fā)過(guò)程質(zhì)量控制帶來(lái)了不確定性。因此，開發(fā)一種高特異性、高敏感性、高通量的檢測(cè)方法對(duì)疫苗的研制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制具有重要意義。

單克隆抗體技術(shù)首先由德國(guó)科學(xué)家Kholer和英國(guó)科學(xué)家Melstein(1975)利用雜交瘤技術(shù)將產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞同骨髓瘤細(xì)胞融合，成功的建立了單克隆抗體制備技術(shù)。該技術(shù)制備的抗體是由識(shí)別一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的均一性抗體，故稱之為單克隆抗體。本發(fā)明應(yīng)用單克隆抗體制備技術(shù)，成功篩選出能分泌目標(biāo)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，該單抗不受檢品中非目標(biāo)蛋白的干擾，可特異性地與吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗、b性流感嗜血桿菌偶聯(lián)疫苗、流腦偶聯(lián)疫苗等疫苗中的破傷風(fēng)類毒素結(jié)合，解決上述疫苗中常規(guī)檢測(cè)方法和應(yīng)用中的不足。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種能產(chǎn)生識(shí)別破傷風(fēng)類毒素特異性強(qiáng)、在檢測(cè)破傷風(fēng)類毒素應(yīng)用中靈敏度特別高的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株、及其單克隆抗體和應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

1.一種分泌特異性結(jié)合破傷風(fēng)類毒素的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株WV-TT-05，其保藏號(hào)為CCTCC?N0：C2014200。

2.抗破傷風(fēng)類毒素的單克隆抗體是由技術(shù)方案1所述的雜交瘤細(xì)胞株WV-TT-05分泌產(chǎn)生。

3.技術(shù)方案2所述的抗破傷風(fēng)類毒素的單克隆抗體在進(jìn)行破傷風(fēng)類毒素特異性檢測(cè)的應(yīng)用。

4.技術(shù)方案2所述的抗破傷風(fēng)類毒素的單克隆抗體在吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗中檢測(cè)破傷風(fēng)類毒素含量的應(yīng)用。

5.技術(shù)方案2所述的抗破傷風(fēng)類毒素的單克隆抗體在以破傷風(fēng)類毒素為載體的偶聯(lián)疫苗中檢測(cè)破傷風(fēng)類毒素含量的應(yīng)用。

6.技術(shù)方案5所述的應(yīng)用，所述的偶聯(lián)疫苗為b型流感嗜血桿菌偶聯(lián)疫苗或流腦偶聯(lián)疫苗。

本發(fā)明所提供的一種分泌特異性結(jié)合破傷風(fēng)類毒素的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株WV-TT-05，已于2014年11月26日(保藏日)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏號(hào)為：CCTCC?N0：C2014200。該保藏中心的地址是：中國(guó),武漢,武漢大學(xué)，郵編：430072，電話：(027)68752319，傳真：(027)6875483，該雜交瘤細(xì)胞株WV-TT-05的存活性于該保藏中心2014年12月3日檢測(cè)為存活。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：