技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種雞天然免疫相關基因MDA5啟動子區域的分離鑒定及其應用。

背景技術

天然免疫又稱非特異性免疫或者固有免疫，主要通過天然免疫分子和細胞來具體實現對病原體的清除和殺滅。宿主細胞通過對病原體的識別，激活一系列的下游級聯反應，最終導致I型干擾素、促炎癥細胞因子、趨化因子等的產生從而抑制病原體的復制、抵抗感染并清除病原體。天然免疫對于病原的識別依賴的是病原分子模式識別受體（PRR）。

黑素瘤差異化相關基因5（Melanoma Differentiation-Associated protein 5，MDA5，又稱Helicard、IFIH1） 是胞質內病原分子模式識別受體，維甲酸誘導基因I樣受體家族（RLRs），包括維甲酸誘導基因蛋白I （retinoic acid-inducible gene I，RIG-I）；遺傳學和生理學實驗室蛋白2（laboratory of genetics and physiology 2，LGP2） 的重要成員之一，其激活的信號轉導途徑對機體啟動抗病毒天然免疫發揮著重作用。MDA5是DexD/H RNA解旋酶。N 端包括2 個串聯重復的半胱天冬酶募集結構域即CARD（Caspase activation and recruitment domain） 域，中間為DExD/H 解旋酶區（ DExD/H helicases），C端是無活性的抑制域（ repressor domain，RD）。其解旋酶結構域介導雙鏈RNA的識別，而CARD結構域能夠招募下游信號分子從而活化干擾素調節因子3(Interferon regulatory Factor 3，IRF3)和核轉錄因子NF-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB，NF-kB）。

在哺乳動物中，MDA5和RIG-I是RIG-I樣解旋酶家族中進化保守的成員，在機體對抗外源RNA病毒感染的過程中起重要的作用。然而，雞中缺少RIG-I， 因此關于MDA5對病毒的識別，自身的激活以及受到的調控的研究就顯得尤為重要，例如解釋為何雞對某些特定的流感病毒有抵抗力，卻對另一些毒株具有高易感性，進而找到增強雞抗病毒能力的方法。

啟動子是目的基因的開關，控制基因的表達，因此研究一個基因啟動子的影響和調控因素，是明白這個基因作用機制及調節因素的一個重要環節，因此對于一個基因研究其啟動子的區間及特性就顯得尤為重要。

研究顯示，在正常情況下，機體MDA5只有基礎水平少量表達，當病毒入侵后，MDA5的表達會大量上調。目前對RIG-I的調控機制研究較多，對MDA5的調控機制尚不清楚，對雞MDA5基因的啟動子的研究未見報道。

發明內容

本發明的目的是研究雞抗病毒能力，增強雞的免疫力。提供一種雞MDA5基因啟動子，所述的MDA5基因啟動子序列如序列表SEQ ID NO：3所示。利用NCBI數據庫查找雞黑色素瘤差異化相關基因MDA5的上游調控序列，預測MDA5啟動子的大概區域。設計如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物片段，以白羽雞基因組DNA為模板，PCR擴增其天然免疫的啟動子區域，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用天根回收試劑盒純化回收，將片段連接在pMD19-T載體上并將擴增到的啟動子序列SEQ ID NO：3片段命名為MDA5-pro，其片段長度為2487b。

將連接在pMD19-T載體上的MDA5啟動子作為模板，設計引物進行PCR擴增，引進PciⅠ和BamHⅠ兩個切酶位點，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用天根回收試劑盒純化回收后，用全式金的pEASY-T1 Cloning Kit試劑盒，將其連接在pEASY-T1載體上，獲得MDA5基因啟動子轉染載體。PciⅠ和BamHⅠ兩個切酶位點的酶切體系是：

試劑 體積（(Volume/μl)）

Buffer 5

目的片段DNA/載體DNA12/4

PciⅠ 1

BamHⅠ1

ddH₂O31/39

總量 50；

所述的酶切條件是37℃，時間為5-6小時。

一種雞MDA5基因啟動子的應用，所述的MDA5基因啟動子用于啟動雞表達目的基因。

以上所述的MDA5基因啟動子還可應用于在受到病毒、干擾素、Poly I:C和IBDV刺激后能驅動目的基因表達。