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[發明專利]一種羊膜上皮細胞分離、培養的方法有效

專利信息
申請號: 201510263291.8 申請日: 2015-05-21
公開(公告)號: CN104818244B 公開(公告)日: 2017-12-29
發明(設計)人: 付寅生;張怡;孟慶雪;劉艷青 申請(專利權)人: 天晴干細胞股份有限公司
主分類號: C12N5/073 分類號: C12N5/073
代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所23109 代理人: 牟永林
地址: 150028 黑龍江省哈爾濱市*** 國省代碼: 黑龍江;23
權利要求書: 查看更多 說明書: 查看更多
摘要:
搜索關鍵詞: 一種 羊膜 上皮細胞 分離 培養 方法
【權利要求書】:

1.一種羊膜上皮細胞分離、培養的方法,其特征在于該方法是按以下步驟完成的:

一、羊膜組織分離和消毒:將羊膜自胎盤上剝離,然后用生理鹽水沖洗2~3遍,再在含有1%~3%頭孢哌酮的生理鹽水中浸泡3~10min;

二、羊膜上皮細胞分離:將羊膜裁剪成50~150cm2的塊狀,然后將裁剪后羊膜的上皮面朝上貼敷于無菌硝酸纖維膜上,向培養皿A中加入3~10mL生理鹽水,再將羊膜的上皮面朝下貼置在培養皿A中,靜置2~3min,獲得羊膜貼片;將羊膜貼片置于培養皿B中,加入10~30ml質量濃度為0.25%的胰酶-EDTA消化15~20min,然后封口膜封口后將培養皿放入恒溫搖床中消化,得到消化液,再加入2~5ml胎牛血清終止酶反應,然后去除羊膜貼片上團聚、黏連的羊膜上皮細胞,再將羊膜貼片轉移至裝有生理鹽水的培養皿C中,清洗貼壁的羊膜上皮細胞,得到清洗液,收集消化液和清洗液,經100目細胞篩過濾,獲得羊膜上皮細胞單細胞懸液;

三、羊膜上皮細胞純化培養:將步驟二獲得的羊膜上皮細胞單細胞懸液在4℃、1500rpm的條件離心5~15min,棄上清,然后加入含有表皮生長因子的低糖DMEM/F12培養基重懸細胞,混勻后按0.9~1.1×105/cm2的接種量接種于培養瓶中,再置于37℃、CO2體積濃度為5%的培養箱中培養,細胞融合率達到85%后,棄除非貼壁細胞,并用生理鹽水沖洗2次,然后加入質量濃度為0.05%的胰酶-EDTA消化,37℃消化2~5min,棄除消化液,再用生理鹽水沖洗1~2次,然后加入質量濃度為0.25%的胰酶-EDTA,在37℃條件下消化3~6min,再加入FBS終止酶反應,收集消化液,將消化液在4℃、1500rpm旋轉震蕩的條件下離心5~15min,棄上清,然后加入DMEM/F12培養基重懸細胞,得到高純度P0代羊膜上皮細胞單細胞懸液,即完成,其中步驟二所述的消化是在37℃,60~120rpm的條件下,消化15~20min。

2.根據權利要求1所述的一種羊膜上皮細胞分離、培養的方法,其特征在于步驟一所述的剝離方式為鈍性剝離。

3.根據權利要求1所述的一種羊膜上皮細胞分離、培養的方法,其特征在于步驟二所述的培養皿A、培養皿B和培養皿C為直徑是9~15cm的培養皿。

4.根據權利要求1所述的一種羊膜上皮細胞分離、培養的方法,其特征在于步驟二中用平頭鑷子、玻璃棒或細胞刮匙去除羊膜貼片上團聚、黏連的羊膜上皮細胞。

5.根據權利要求1所述的一種羊膜上皮細胞分離、培養的方法,其特征在于步驟三按1.0×105/cm2的接種量接種于培養瓶中。

6.根據權利要求1所述的一種羊膜上皮細胞分離、培養的方法,其特征在于步驟三所述的含有表皮生長因子的低糖DMEM/F12培養基中表皮生長因子的終濃度為10ng/ml。

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