技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種定量檢測降鈣素原的方法。

背景技術

降鈣素原(procalcitonin，PCT)是無激素活性的降鈣素前肽物質，降鈣素僅在甲狀腺的C細胞受到激素性刺激時才產生，降鈣素原可由很多器官的不同類型細胞在受到促炎癥反應刺激特別是受到細菌引起的刺激后分泌。

降鈣素原是一種能特異性區分細菌感染和其它原因導致的炎癥反應的重要標志物，當嚴重細菌、真菌、寄生蟲感染以及膿毒癥和多臟器功能衰竭時，其在血漿中的水平升高。臨床資料顯示，PCT濃度>0.1ng/mL時說明存在臨床相關的細菌感染，需要采用抗生素進行治療；當PCT濃度>0.5ng/mL時，要考慮患者可能有發展成重癥敗血癥或敗血癥性休克的危險。PCT反映了全身炎癥反應的活躍程度。影響PCT水平的因素包括被感染器官的大小和類型、細菌的種類、炎癥的程度和免疫反應的狀況。檢測病例中PCT濃度的變化，有利于判斷機體細菌感染情況，評判機體健康狀況，對臨床和基礎性研究都有重要意義。

自上世紀80年代以后，免疫學檢測技術隨著單克隆抗體、人工合成多肽、基因工程表達抗原及各種標記技術的成熟而迅速發展，免疫比濁法、速率散射比濁法(INA)、膠乳增強透射比濁法(ITA)與化學發光分析技術逐漸取代傳統的免疫沉淀、免疫凝集物，使檢測更為快捷，近些年快速檢測(POCT)的應用使免疫學操作更為簡單、方便。

目前，多種免疫學檢測技術應用于PCT檢測，既可以定性，亦可以定量。常用方法有放射免疫分析法(RIA)、酶標免疫分析法(ELISA)、膠體金法、定量化學發光免疫分析(CLIA)，但以上方法在應用過程中均存在缺陷。放射免疫(RIA)、酶標免疫(ELISA)靈敏度較高，但操作復雜、產品有效期短；膠體金操作簡單快捷，但不能定量檢測；定量化學發光免疫檢測需要較長時間且檢測成本高。因此還需要研發一種新的檢測降鈣素原的方法，以便于快速、準確檢測樣品中的降鈣素原。

發明內容

本發明的發明目的在于提供一種定量檢測降鈣素原的方法，其穩定性、線性、準確性均有顯著提高。

為了實現本發明的發明目的，本發明采用如下技術方案：

將待檢測樣品與熒光標記的抗降鈣素原第一抗體混合，得到含降鈣素原抗原抗體復合體的反應液；將該反應液在反應介質中分別與抗降鈣素原第二抗體、降鈣素原抗原反應，分別檢測熒光信號；根據標準曲線及測得熒光信號值獲得待檢測樣品中降鈣素原的含量。

作為優選，所述熒光標記所用的熒光素為Alexa?Fluor系列熒光素。

作為優選，所述反應介質為試紙條。

更優選地，所述抗降鈣素原第二抗體、降鈣素原抗原固定在同一反應介質的不同位置。

本發明提供的定量檢測降鈣素原方法是一項基于免疫熒光法的定量檢測技術，結合了雙抗體夾心法與競爭法，將待測樣本與含熒光標記的抗降鈣素原第一抗體的緩沖液在試劑瓶中進行混合得反應液，混合液中的熒光標記PCT抗體和樣本的PCT抗原結合形成抗原抗體復合物；取反應液在反應介質中與抗降鈣素原第二抗體反應，捕獲待測樣品中含有的降鈣素原與熒光標記的抗降鈣素原抗體復合物，檢測、收集第一熒光信號；取所得反應液在反應介質中與降鈣素原抗原反應，競爭結合反應液中的熒光標記的抗降鈣素原抗體，檢測，收集第二熒光信號；根據第一熒光信號、第二熒光信號及標準曲線，計算獲得待檢測樣品中降鈣素原的含量。

優選的方案是所述反應介質為試紙條，所述抗降鈣素原第二抗體、降鈣素原抗原固定在反應介質的不同位置，利用免疫層析法進行檢測。免疫層析法(immunochromatography)其原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區帶，當該干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品后，由于毛細作用，樣品將沿著該膜向前移動，當移動至固定有抗體的區域時，樣品中相應的抗原即與該抗體發生特異性結合，用免疫膠體金或免疫熒光標記從而實現特異性的免疫檢測。

試紙條上固定了抗降鈣素原第二抗體的位置為檢測線，當混合樣本滴到試紙條并通過毛細作用擴散到硝酸纖維素膜的檢測線上，熒光標記的抗原抗體復合物被檢測線上的PCT第二抗體所捕獲。待測樣本中的PCT抗原越多，檢測線上的復合物積聚得越多，熒光抗體的信號越強。

試紙條上固定了抗降鈣素原的位置為質控線，當混合樣本滴到試紙條并通過毛細作用擴散到硝酸纖維素膜的質控線上，熒光標記的抗原抗體復合物被質控線上的PCT抗原所捕獲。血液樣本中的PCT抗原越多，質控線上的復合物積聚得越少，熒光抗體的信號越弱。