技術領域

本發明涉及植物組織培養技術領域，具體的涉及一種人參不定根誘導增殖方法。

背景技術

人參(Panax?ginseng?C.A.Meyer)是五加科人參屬多年生雙子葉植物，為古老而名貴的中藥材，具有調節人體免疫力、抗癌和抗糖尿病等多種作用。人參皂苷是其主要的活性物質。近年來，國內外對于人參的需求快速增長。但是，由于長期過度采挖，人參野生資源已基本枯竭，且人參栽培周期長，易受氣候、病蟲害及栽培條件的影響，難以滿足越來越大的市場需求。人參組織培養技術周期短，不受季節限制，容易進行大規模的工業化生產，具有很大的發展前景。

利用發根農桿菌誘導人參產生的發根生長迅速，皂苷種類與田間栽培的人參相同，含量比普通的細胞培養物高，且利用生物反應器大規模培養人參發根的體系也已建立[Jeong?GT,Park?DH,Hwang?B,et?al.Comparison?of?growth?characteristics?of?Panax?ginseng?hairy?roots?in?various?bioreactors[J].Appl?Biochem?Biotechnol,2003,107:493]。然而，由于發根誘導過程中外源基因的導入具有潛在的安全性問題，因此該技術沒有用于商業化。

近年來，不經過發根農桿菌轉化直接誘導人參不定根的研究取得了較大進展。但不定根一般是由人參愈傷組織誘導產生的[Sivakumar?G,Yu?KW,Paek?KY.Production?of?biomass?and?ginsenosides?from?adventitious?roots?of?Panax?ginseng?in?bioreactor?cultures[J].Eng?Life?Sci,2005,4:333]。上述方法的缺陷在于：需要先誘導愈傷組織，導致實驗周期長。

因此，有必要提供一種簡便的直接利用人參組培苗作為外植體的不定根誘導增殖方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用人參組培苗的根、莖段或葉片誘導不定根產生及對不定根進行增殖培養的方法。

為達到以上目的，本發明提供了一種不定根誘導增殖方法，包括以下步驟：

將人參組培苗切割成組織小塊后接種于固體誘導培養基中誘導形成不定根，將所述不定根切割成不定根小塊后接種于液體增殖培養基中進行不定根的增殖培養；

其中，所述固體誘導培養基和液體增殖培養基為以1/2MS(-N)培養基為基本培養基含有濃度為1-10mg/L的吲哚丁酸(IBA)。

優選的為了獲得更好的人參不定根誘導增殖效果，所述固體誘導培養基和液體增殖培養基為以1/2MS(-N)培養基為基本培養基含有濃度為2-5mg/L的吲哚丁酸。

可選的，所述固體誘導培養基和液體增殖培養基還含有濃度為1.8-2.2質量％的蔗糖。

可選的，所述誘導增殖方法包括以下步驟：

1)將人參組培苗切割成組織小塊，利用固體誘導培養基在培養溫度為23-25℃的黑暗條件下誘導培養3-6周獲得不定根；

2)將步驟1)獲得的不定根切割成不定根小塊，利用液體增殖培養基在培養溫度為23-25℃的黑暗條件下以50-80rpm的速度震蕩培養3-9周。

可選的，所述組織小塊為對人參組培苗根進行切割獲得的人參組培苗根小塊、對人參組培苗莖段進行切割獲得的人參組培苗莖小塊或對人參組培苗葉片進行切割獲得的人參組培苗葉小塊。

可選的，所述人參組培苗為經種子萌發或者外植體離體培養獲得的組培苗，組培苗的日齡為28-32天。

可選的，所述人參組培苗的品種為石柱參或大馬牙參。

利用本發明所提供的方法，可以顯著提高誘導獲得的不定根數量，而且，將誘導獲得的不定根進行增殖培養后，與利用愈傷組織進行不定根誘導的方法相比不定根增殖率更高，增殖效果更好。此外本發明所提供的方法可以大大縮短獲得人參不定根的時間，通過直接對人參組培苗進行不定根誘導增殖避免了將組培苗培養成完整植株后取得外植體進行愈傷組織誘導培養的步驟，縮短了實驗周期。為利用人參不定根生產人參皂苷奠定了良好的基礎，也為利用人參不定根進行代謝途徑的基礎研究提供了重要的材料。

附圖說明

圖1為人參組培苗不同組織誘導增殖產生的不定根；

圖中，(A)為利用人參組培苗根誘導培養不定根的情況；(B)為利用人參組培苗莖段誘導培養不定根的情況；(C)為利用人參組培苗葉片誘導培養不定根的情況。

圖2為人參組培苗不同組織誘導產生不定根的增殖情況；