技術領域

本發明屬于醫藥制劑領域，特別涉及一種制備河豚毒素的方法。

背景技術

河豚毒素(tetrodotoxin)是一種氨基全氫喹唑啉型化合物，具有籠型原酸酯結構，如下所示：

其為白色結晶，無臭無味，微溶于水，不溶于有機溶劑；河豚毒素的結構特征是有1個碳環，1個胍基，6個羥基，在C-5和C-10位有一個半醛糖內酯連接著的分開的環。它是相當特殊的一種有機化合物，分子內的胍基與氮原子是質子化的，正羰酸也離解為陰離子，所以河豚毒素是以內鹽形式存在。河豚毒素(tetrodotoxin)在臨床具有戒毒和鎮痛不成癮的臨床效果、也有其降壓、局麻、抑瘤的方面的功效。

河豚毒素(tetrodotoxin)在原生物中的含量很少，一般在百萬分0.1-5這個數量級上，所以在提取中前處理的量非常大，并且河豚毒素浸泡后有大量的游離氨基酸、肽類、脂肪、蛋白、膠體物質、無機鹽等非目標產物存在于浸泡液中，國內外科研工作者基本都采用將浸泡液加熱煮沸雜質變性沉淀，再通過速冷、沉降、過濾或離心的方法除去浸泡液中的蛋白等沉淀雜質。但此方法中由于要加熱煮沸，而河豚毒素對熱極不穩定，在80OC時加熱30分鐘損失11.8％，在90OC時加熱30分鐘損失31.2％，這樣就不僅造成了河豚毒素的損失，而且降低了河豚毒素的收率。

對河豚毒素(tetrodotoxin)的提取分離國內外有很多相關報道，國內外科研工作者提取河豚毒素基本都是用氧化鋁柱層析、濾紙層析、離子交換和碳柱吸附，還有用兩步樹脂交換的得到河豚毒素(tetrodotoxin)粗結晶，再用苦味酸成鹽法反復重結晶，從而得到純的河豚毒素結晶，純度約為95％，但此方法不能完全將與河豚毒素性質極其相近的其異構體4-表河豚毒素(tetrodotoxin)分離出來。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種可提高河豚毒素的收率且能較好的將河豚毒素與4-表河豚毒素分離開來的制備河豚毒素的方法。

本發明提供了一種制備河豚毒素的方法，具體包括如下步驟：

步驟一：浸泡

將河豚魚肝或魚子切成條或塊后，用去離子水或純化水浸泡，得到料液，浸泡至料液不再含毒為止；

步驟二：沉降

將步驟一所得的料液置于6～10℃沉降放置10～12小時，分出上清液，并將沉淀物離心并過濾除渣后再與上清液混合得到澄清液；

步驟三：絮凝

將步驟二所得的澄清液用氨水溶液調PH至7～9，加入絮凝劑溶液調節PH至4～6，攪勻，靜置沉降，然后分出上清液，并將沉淀物經過高速離心并過濾除渣后再與上清液混合；

步驟四：離子交換

將步驟三混合所得的料液，上離子交換柱，交換至PH6.5～7.0,交換結束后用去離子水或純化水沖柱至澄清，然后以醋酸溶液洗脫，收集含目標產物的組分，以氨水溶液調PH至5～7，減壓濃縮得到濃縮液。

步驟五：低壓柱層析

將步驟四所得的濃縮液和干硅膠拌好，上低壓硅膠柱進行分離，并加入組成為正丁醇、醋酸和水的洗脫液進行洗脫，收集含目標產物的流出液部分，過濾得到濾液，減壓濃縮得到濃縮液。

步驟六：高效液相色譜柱

將步驟五所得濃縮液注入平衡后的高效液相色譜柱,以醋酸溶液洗脫，收集含目標產物的流出液減壓濃縮，得到濃縮液。

步驟七：結晶

將步驟六所得的濃縮液用氨水溶液調PH至8～9，冷藏，析出結晶，濾出，用無水乙醇洗滌，常溫減壓干燥即得河豚毒素高純單體結晶。

所述步驟一中，所述河豚魚肝或魚子是切成1～2cm的條或塊，置不銹鋼浸泡槽中加1～2倍的去離子水或純化水在6～10℃浸泡，并適時攪拌，18～24小時后將料液從不銹鋼浸泡槽的下口放出至儲料槽或沉降罐中。

所述步驟三中，是將步驟二所得的澄清液用25％的氨水溶液調PH至7～9，加絮凝劑溶液至PH4～6，以50～300rpm/min的速度攪拌5～10min，在溫度為6～10℃下靜置沉降18～24小時，分出上清液后，將沉淀物經過高速離心機，在轉速為5000～10000rpm/min下離心20～40分鐘，并過濾除渣后再與上清液混合。

所述絮凝劑為聚合硫酸鐵、聚合硫酸鋁、聚丙烯酰胺或聚合氯化鋁，投放量為0.01～5g/L。