本申請(qǐng)是一件發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為2013年5月3日，申請(qǐng)?zhí)枮?01310162455.9，發(fā)明創(chuàng)造名稱為“強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序及其應(yīng)用”。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)工程和基因工程領(lǐng)域，涉及一類強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)的分泌系統(tǒng)不僅是蛋白質(zhì)分選、定位和實(shí)現(xiàn)生理功能的前提，更是基因工程及蛋白質(zhì)工程技術(shù)開(kāi)發(fā)的重要手段。人們已經(jīng)研究出多種原核和真核表達(dá)系統(tǒng)用以生產(chǎn)重組蛋白。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)以其遺傳背景清楚、操作簡(jiǎn)單、能在廉價(jià)培養(yǎng)基中迅速生長(zhǎng)及易于大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)等特點(diǎn)而備受關(guān)注；目前大腸桿菌體系已用于制備多種酶制劑，甚至一些藥用蛋白質(zhì)，如干擾素、胰島素和人血清蛋白等，在生物技術(shù)領(lǐng)域取得了令人矚目的成果。

在大腸桿菌中，重組蛋白在原則上可以被以下幾種方式生產(chǎn)：1、可溶性蛋白胞內(nèi)生產(chǎn)；2、包涵體胞內(nèi)生產(chǎn)；3、分泌至周質(zhì)空間或胞外培養(yǎng)基中。大腸桿菌體系適合于生產(chǎn)翻譯后無(wú)需修飾加工的蛋白質(zhì)，且由于大腸桿菌缺乏蛋白折疊過(guò)程中需要的輔助因子，往往使中間體大量積聚，易形成包涵體沉淀，還須經(jīng)過(guò)復(fù)性等繁瑣過(guò)程；而周質(zhì)氧化型的氧化還原環(huán)境有利于蛋白質(zhì)的折疊。如果蛋白質(zhì)跨過(guò)細(xì)胞的內(nèi)膜定位于周質(zhì)空間，甚至穿過(guò)細(xì)胞外膜直接分泌至胞外培養(yǎng)基中，可以極大簡(jiǎn)化下游復(fù)性及分離純化工藝，減少表達(dá)蛋白對(duì)宿主菌的毒性和代謝負(fù)擔(dān)，顯著提高表達(dá)量。

現(xiàn)有的分泌表達(dá)體系大多數(shù)是分泌到周質(zhì)空間，獲取重組蛋白仍然需要細(xì)胞破碎和純化。少數(shù)分泌到胞外的則由于大腸桿菌本身的蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)不夠完善，或人類對(duì)其分泌系統(tǒng)認(rèn)識(shí)的局限性，導(dǎo)致了分泌效率極低及融合蛋白的后加工問(wèn)題。

信號(hào)肽是一類10-60個(gè)氨基酸左右的多肽，一般位于分泌蛋白的N端。利用信號(hào)肽分泌表達(dá)蛋白，一般操作方法是將目的蛋白的編碼基因克隆到信號(hào)肽序列后端，在宿主中實(shí)現(xiàn)目的基因和信號(hào)肽序列在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的融合，依靠蛋白質(zhì)前體N端信號(hào)肽引導(dǎo)整個(gè)多肽鏈與胞內(nèi)分子伴侶或分泌信號(hào)識(shí)別顆粒的結(jié)合、膜定位或分泌出胞外。

盡管胞外分泌表達(dá)策略相比其他表達(dá)方式有著顯著的優(yōu)勢(shì)，但是目前在大腸桿菌體系中廣泛運(yùn)用此種策略仍有諸多限制。因此，擁有能夠攜帶目的蛋白分泌出胞外的信號(hào)肽是先決條件，并且即使信號(hào)肽具有介導(dǎo)蛋白胞外分泌的能力，也并不表明特定的信號(hào)肽對(duì)所有的重組蛋白具有這種介導(dǎo)能力或者具有同樣水平的介導(dǎo)能力。每個(gè)重組蛋白具有自己特定的編碼基因，信號(hào)肽和重組蛋白的過(guò)渡點(diǎn)序列不同，而且重組蛋白自身的結(jié)構(gòu)也有差異，因而重組蛋白的分泌水平取決于其信號(hào)肽的最優(yōu)化水平、目標(biāo)蛋白有利的跨膜結(jié)構(gòu)以及它們之間的匹配度水平。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，分泌蛋白穿越質(zhì)膜的基本分泌途徑以Sec或Tat這兩種系統(tǒng)為主，例如外膜蛋白(OmpA)信號(hào)肽、果膠酸脂裂解酶(PelB)信號(hào)肽通過(guò)Sec途徑，三甲胺N氧化物還原酶(TorA)信號(hào)肽通過(guò)Tat途徑，這兩種類型的信號(hào)肽都有成功運(yùn)用于分泌表達(dá)外源蛋白的案例。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的技術(shù)目的在于提供一種具有增強(qiáng)信號(hào)肽分泌效率的功能的強(qiáng)分泌性信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序，使得通過(guò)在諸如ompA信號(hào)肽或pelB信號(hào)肽前端融合添加本發(fā)明的小肽模序，可以實(shí)現(xiàn)上述信號(hào)肽在大腸桿菌體系中的分泌表達(dá)外源蛋白的能力。

本發(fā)明的另一個(gè)技術(shù)目的在于提供上述具有增強(qiáng)信號(hào)肽分泌效率的功能的強(qiáng)分泌信號(hào)肽增強(qiáng)小肽模序的應(yīng)用，即將此小肽模序用于構(gòu)建一種增強(qiáng)普通信號(hào)肽分泌能力的載體，以提高其分泌表達(dá)外源蛋白的方法。

本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“分泌”，是指蛋白質(zhì)或肽的分子被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)菌細(xì)胞的外部，而且它也包括這樣的情況：其中蛋白質(zhì)或肽分子最終以完全游離的形式置于培養(yǎng)基中，以及其中部分蛋白質(zhì)處在細(xì)菌外部或部分蛋白質(zhì)存在于細(xì)菌的周質(zhì)空間。

本發(fā)明中使用的下列術(shù)語(yǔ)除非特別說(shuō)明具有如下的含義：

蛋白質(zhì)氨基酸或多核苷酸的“變體”是指具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或編碼它的多核苷酸序列。所述“改變”可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替換。變體可具有保守性改變，其中替換的氨基酸具有與原氨基酸相類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸。變體也可以具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。