技術領域

本發明涉及用實時熒光定量PCR（Real-time?fluorescence?quantitative?PCR）技術對谷子銹菌進行定量檢測，屬于植物真菌分子生物學檢測技術領域。

背景技術

谷子（Setaria?italica）屬禾本科（Cramineae）黍亞科（Panicoideae）、黍系（Panicatae）、黍族（Paniceae）、狗尾草亞族（Setaviineae）狗尾草屬（Setaria），是我國起源較早的一種作物，在中國北方地區廣泛種植。谷子抗旱耐瘠、營養豐富，是我國重要的食品和飼用谷物。但是由于谷子病害的發生，導致谷子產量和質量下降。谷子銹病是世界谷子產區經常發生的一種病害，嚴重影響谷子生產。銹病流行年份，無論是夏谷區、春谷區還是夏谷與春谷混種區的感病品種產量損失嚴重，一般減產30%以上，嚴重地塊甚至顆粒不收。

谷子銹病病原菌Uromyces?setariae-italicae，屬擔子菌亞門（Basidiomycotina），單胞銹屬（Uromyces）。谷子銹病在谷子的葉片和葉鞘上都可發生，但在葉片上發生更加嚴重。發病初期，在葉片表面與葉背面，特別是背面產生紅褐色斑點，稍隆起，即銹菌的夏孢子堆。葉片上一般可產生許多夏孢子堆，成熟后突破寄主表皮而外露，增強了植株的蒸騰作用，使植株喪失大量水分，減少光合作用面積，嚴重時夏孢子堆布滿葉片，造成葉片枯死。發病后期，在病株的葉背和葉鞘上，尤其葉鞘上散生大量灰黑色小點，即銹菌的冬孢子堆。冬孢子堆大都生長在葉片的腹面或葉鞘上，長期埋生在寄主的表皮下，故癥狀不明顯。谷子銹菌為專性寄生菌，有高度的致病性分化，各地存在不同的生理小種。谷子銹病除為害谷子外，還能侵染青狗尾草、莠狗尾草、倒刺狗尾草、谷莠子、中型狗尾草、輪生狗尾草及印度高野黍等。

由于在病害發生的早期階段，癥狀并不明顯，用傳統的方法很難發現，延誤了控制病害的最佳時機。近年來，分子生物學技術的發展為植物體內病原菌的快速、準確診斷提供了有效的工具。實時熒光定量PCR是近幾年發展起來的將PCR技術與熒光檢測相結合的技術，實現了PCR從定性分析到定量檢測的飛躍，通過對熒光信號的采集，達到實時監測PCR過程的目的，從而實現對體系中模板DNA的定量分析。潘娟娟等利用實時熒光定量PCR檢測到小麥條銹菌侵入小麥葉片12小時后小麥葉片內的條銹菌含量。M.S.?Hamada?等利用實時熒光定量PCR檢測并定量小麥莖上的禾谷絲核菌（Rhizoctonia?cerealis）。Ronald?J.?Sayler?等利用real-time?PCR?檢測了水稻中立枯絲核菌（Rhizoctonia?solani）AG-1?IA?，靈敏度達到1pg。Bohm等、Gachon等、Mercado-Blanco等也都利用實時熒光定量PCR檢測了病原菌在植物體內的變化規律。因此，實時熒光定量PCR技術為快速、準確的檢測谷子銹菌提供了技術支持，能夠更早、更及時的發現病原菌，對谷子銹病的早期檢測和防治具有重要意義。

發明內容

本發明提供了一種通過實時熒光定量PCR技術檢測并準確定量谷子中銹菌的方法，通過該方法可快速診斷出谷子植株中是否攜帶銹菌并得到銹菌的具體含量。該方法能大大縮短檢測周期，為銹病的預防和病情的控制提供保障。

本發明的具體步驟是：

1、提取谷子銹菌基因組DNA，以ITS通用引物擴增銹菌基因組DNA，其上游引物和下游引物堿基序列如序列表中SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示。PCR擴增獲得727bp的特異性片段，片段回收純化后與PMD19-T載體連接過夜，通過熱激法轉入大腸桿菌JM109感受態細胞中，挑取轉化菌落進行PCR檢測，把插入目的片段的克隆送上海生工進行測序，測序分析后獲得該特異片段核苷酸堿基序列如序列表中SEQ?ID?No.3所示。把測定的序列的陽性克隆提取質粒，利用NanoDrop?1000測定質粒濃度，方便后續系列稀釋；

2、實時熒光定量PCR引物設計

根據銹菌核糖體ITS序列測序結果，應用Primer?Premier?5.0軟件設計了特異性引物序列SEQ?ID?No.4和SEQ?ID?No.5：

SEQ?ID?No.4???rustf???GGTGCACTTAATTGTGGCTCAA

SEQ?ID?No.5???rustr???CTCCTTTTCTTTTTCCCTCTCAAA