[發(fā)明專利]促卵泡生成素(FSH)定量測(cè)定試劑盒及其制備方法與檢測(cè)方法在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201410187359.4 | 申請(qǐng)日: | 2014-05-05 |
| 公開(公告)號(hào): | CN105092862A | 公開(公告)日: | 2015-11-25 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人: | 楊旻;汪丹;夏振偉 | 申請(qǐng)(專利權(quán))人: | 江蘇澤成生物技術(shù)有限公司 |
| 主分類號(hào): | G01N33/74 | 分類號(hào): | G01N33/74;G01N33/533;G01N21/64 |
| 代理公司: | 北京聯(lián)瑞聯(lián)豐知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11411 | 代理人: | 曾少麗 |
| 地址: | 214000 江蘇省無*** | 國省代碼: | 江蘇;32 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 卵泡 生成 fsh 定量 測(cè)定 試劑盒 及其 制備 方法 檢測(cè) | ||
1.一種促卵泡生成素(FSH)定量測(cè)定試劑盒,其特征在于,該試劑盒包括:校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、抗試劑、磁微粒試劑和發(fā)光底物;所述試劑盒中各組分按照如下方法制備:
一、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品的配制:
采用校準(zhǔn)品緩沖液溶解促卵泡生成素(FSH),配置校準(zhǔn)品和質(zhì)控品;其中,所述校準(zhǔn)品緩沖液是通過在1L新生牛血清中加入0.01g~0.05g的四環(huán)素和0.1g~0.5g硫酸新霉素,溶解后經(jīng)過0.22μm濾膜處理制備;
二、抗試劑的配制:
(1)、抗試劑緩沖液的制備:
Tris:12.12mg~60.57mg,四環(huán)素:0.01g~0.05g,綿羊血清:1g~5g,新生牛血清3g~10g,馬血清1g~5g加入1L純化水中,充分?jǐn)嚢柚镣耆芙猓?/p>
(2)、將異硫氰酸熒光素標(biāo)記的促卵泡生成素(FSH)包被抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記的促卵泡生成素(FSH)標(biāo)記抗體加入到所述抗試劑緩沖液中充分?jǐn)嚢柚镣耆芙猓?/p>
三、磁微粒試劑的制備:
將抗異硫氰酸熒光素抗體與羧基磁珠偶聯(lián)制得磁微粒試劑;
四、發(fā)光底物的制備:
將ALPS溶解于發(fā)光底物緩沖液中制得發(fā)光底物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促卵泡生成素(FSH)定量測(cè)定試劑盒,其特征在于,所述抗試劑的制備方法如下:
(1)、異硫氰酸熒光素與促卵泡生成素(FSH)的偶聯(lián),獲得異硫氰酸熒光素標(biāo)記的促卵泡生成素(FSH)包被抗體:
首先用抗試劑緩沖液將異硫氰酸熒光素配制成濃度為1.0~5.0mg/mL的異硫氰酸熒光素溶液,按照促卵泡生成素(FSH)與異硫氰酸熒光素的質(zhì)量之比為1:1.1的量,將二者轉(zhuǎn)移到棕色玻璃瓶中,室溫下攪拌1~2小時(shí);充分反應(yīng)后使用pH=8~9的碳酸氫鹽緩沖液,進(jìn)行平衡,然后凝膠層析分離純化出異硫氰酸熒光素標(biāo)記的促卵泡生成素(FSH)抗體包被抗體;
(2)、堿性磷酸酶與促卵泡生成素(FSH)的偶聯(lián),獲得堿性磷酸酶標(biāo)記的促卵泡生成素(FSH)標(biāo)記抗體:
首先用抗試劑緩沖液將堿性磷酸酶配制成濃度為1.0~5.0mg/mL的堿性磷酸酶溶液;按照堿性磷酸酶與促卵泡生成素(FSH)抗體的摩爾比為1:2~1:10的量將二者轉(zhuǎn)移至棕色瓶中,室溫下攪拌4~5小時(shí),充分反應(yīng)后使用pH=8~9的碳酸氫鹽緩沖液平衡,然后使用凝膠層析分離純化出堿性磷酸酶標(biāo)記的FSH標(biāo)記抗體;
(3)、將步驟(1)中獲得的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的促卵泡生成素(FSH)包被抗體和步驟(2)中獲得的堿性磷酸酶標(biāo)記的促卵泡生成素(FSH)標(biāo)記抗體,加入到含有表面活性劑的Tris鹽緩沖液中,充分?jǐn)嚢韬螳@得所述抗試劑;所述表面活性劑為Tween20、TritonX-100、Bronidox中的一種或多種,表面活性劑的添加量為0.01%~0.5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促卵泡生成素(FSH)定量測(cè)定試劑盒,其特征在于,所述磁微粒試劑是按照以下步驟制備的:
(1)、取一定體積的充分混勻后的羧基磁珠濃縮液至反應(yīng)瓶中,將該反應(yīng)瓶在磁場(chǎng)中放置15min,待羧基磁珠全部沉降后吸去上清,向反應(yīng)瓶中加入2~5倍于反應(yīng)瓶中羧基磁珠體積的磁微粒緩沖液,震蕩清洗20-30min;再將反應(yīng)瓶置于磁場(chǎng)中15min后吸去上清;重復(fù)清洗羧基磁珠3遍;最后將羧基磁珠溶液定容到10-50mg/mL,混勻;所述磁微粒緩沖液的配置方法是:Tris:12.12mg,氯化鈉5.82mg,甲基纖維醚50g,加入1L純化水中,充分?jǐn)嚢柚镣耆芙猓?/p>
(2)、連接反應(yīng):按照羧基磁珠與抗異硫氰酸熒光素抗體的質(zhì)量比為100:1的比例,在羧基磁珠中加入抗異硫氰酸熒光素抗體,2~8℃下保持混勻狀態(tài)反應(yīng)18小時(shí);
(3)、反應(yīng)瓶在在磁場(chǎng)放置15min,待羧基磁珠沉降后用磁微粒緩沖液洗3遍,隨后定容至10mg/mL,2~8℃保存,制得所需的磁微粒試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促卵泡生成素(FSH)定量測(cè)定試劑盒,其特征在于,所述發(fā)光底物是按照以下步驟制備的:
用4~10倍于ALPS體積的發(fā)光底物緩沖液充分溶解ALPS;所述發(fā)光底物緩沖液的配置方法是:Tris12.12g~121.14g,氯化鈉5.82g,光澤精0.3g,加入1L純化水中,充分?jǐn)嚢柚镣耆芙猓名}酸調(diào)節(jié)緩沖液的pH至9.5。
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