技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病毒檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測鹿流行性出血病病毒的引物對及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

鹿流行性出血病（epizootic?haemorrhagic?disease?of?deer，EHD）是一種季節(jié)性、非接觸性的病毒性傳染病。鹿流行性出血病病毒（EHDV）也是呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)的成員，是通過節(jié)肢動(dòng)物（主要是庫蠓）傳播的雙股RNA病毒。在自然條件下，鹿流行性出血病病毒可引起牛、綿羊等家畜及白尾鹿、糜、大角羚羊等多種馴養(yǎng)和野生反芻動(dòng)物感染。臨床特征為體溫短暫升高，呈休克癥狀，粘膜和漿膜出血，于昏迷狀態(tài)下死亡。病變呈廣泛性充血、出血、嚴(yán)重水腫和血管壞死，有時(shí)出現(xiàn)腹膜水腫。目前EHD共發(fā)現(xiàn)8個(gè)血清型，分別是EHDV-1、EHDV-2、EHDV-3、EHDV-4，EHDV-5、EHDV-6、EHDV-7、EHDV-8等。EHDV在形態(tài)結(jié)構(gòu)上與藍(lán)舌病病毒極為相似，血清學(xué)上與藍(lán)舌病有明顯交叉，其VP7蛋白是病毒可溶性群特異性抗原，VP7基因也是EHDV群特異性分子檢測的靶基因。本病目前尚無有效疫苗和治療措施，控制和消滅EHD必須花費(fèi)大量的人力物力，出口貿(mào)易也因此受限，給EHDV流行的國家?guī)砗艽蟮慕?jīng)濟(jì)損失。EHDV的快速檢測方法和試劑是動(dòng)物檢疫中急需解決的關(guān)鍵技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是一種用于鹿流行性出血病病毒的引物對。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供一種鹿流行性出血病病毒的檢測試劑盒。

技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一種用于檢測鹿流行性出血病病毒的引物對，所述引物對的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2。

一種鹿流行性出血病病毒的檢測試劑盒，它包含所述的引物對。

上述的鹿流行性出血病病毒的檢測試劑盒，包括：

1）預(yù)混劑A：由核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1的上游引物P120μL，核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2的下游引物P220μL，2×PCR?pre-mix200μL，ddH₂O100μL組成；

2）陰性對照：非鹿流行性出血病病毒的DNA片段600μL；

3）陽性對照：鹿流行性出血病病毒的DNA片段600μL。

上述的鹿流行性出血病病毒的檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：

1）抽提鹿流行性出血病病毒的質(zhì)粒；

2）PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系為50μL體系，反應(yīng)體系中含PCR?pre-mix?12μL，上下游Primer各1μL，上述病毒質(zhì)粒?2μL，H₂O?34μL，瞬時(shí)離心混勻；PCR工作程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30?s，58℃退火1min30?s，72℃延伸1min，15個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10?min。

3）?PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：本發(fā)明一種用于鹿流行性出血病病毒的引物對，在特異引物對的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了PCR條件，擴(kuò)增出了鹿流行性出血病病毒的核苷酸序列，并優(yōu)化了檢測條件和檢測體系制備了檢測該病毒的試劑盒。該試劑盒具有較高的特異性和穩(wěn)定性，靈敏度達(dá)6pg，可以快速準(zhǔn)確檢測鹿流行性出血病病毒。

附圖說明

圖1：PCR方法特異性實(shí)驗(yàn)的電泳圖；其中，泳道1為DNAmaker，泳道2和3分別為豬和雞相關(guān)病毒的質(zhì)粒擴(kuò)增后產(chǎn)物，泳道3為本發(fā)明的鹿流行性出血病病毒的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：試劑盒的制備。

1、病毒及病料的來源和處理

鹿流行性出血臨床病料于2009年10月采自河南鹿內(nèi)臟器官。取0.6g?內(nèi)臟組織于無菌研缽，加生理鹽水研磨，反復(fù)凍溶3次后6000?rmp?離心4min，取上清于-20℃保存。

2、試劑

PCR?pre-mix、蛋白酶K購自大連Takara公司；DNA?Marker、GoldView購自南京上高生物公司；引物由Sigma公司合成。其它試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

1、?引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中EHD的全基因序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0設(shè)計(jì)一對檢測引物。EHD?VP7上游引物P1為:?5'-GGCAGCGCCAGAAGTTACC-3'；