本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2007年04月10日，申請(qǐng)?zhí)枮椤?00780013086.X”，國際申請(qǐng)?zhí)枮椤癙CT/US2007/008857”，名稱為“檢測遺傳突變的方法”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

本申請(qǐng)要求2006年4月10日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)No.60/790,535和2007年1月5日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)No.60/878,700的優(yōu)先權(quán)，將這兩個(gè)申請(qǐng)的全部內(nèi)容于此通過引用并入。

本發(fā)明以美國國立衛(wèi)生研究院授予的ROI?GM065057受到政府資助。政府擁有本發(fā)明的某些權(quán)利。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測遺傳性變型的方法，包括與抗藥性、癌、遺傳功能障礙性疾病相關(guān)的遺傳性變型的方法。

發(fā)明背景

結(jié)合藥物治療或高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)是治療人類免疫缺陷病毒(HIV)感染個(gè)體的主要方法。由于HAART可以將患者血液中的病毒復(fù)制抑制至檢測不到的水平，因此己顯著降低了HIV感染患者的發(fā)病率和死亡率(Egger等,BMJ315:1194-9(1997)，Pa1ella等,N?Eng1J?Med338:853-60(1998))。然而，對(duì)于HAART的反應(yīng)經(jīng)常是易變的。有些患者反應(yīng)良好，可以成功抑制病毒的復(fù)制，而其它患者在HAART之后不久就治療失敗了。來自HAART治療失敗患者的蛋白酶和反轉(zhuǎn)錄酶(RT)基因序列分析顯示對(duì)多種藥物的抗性(Condra等,J?Virol70:8270-6(1996)，Larder?and?Kemp,Science246:1155-8(1989)，Johnson等,Top.HIV?Med.13:125-131(2005))。這些突變株的生物功能已經(jīng)通過體外分析而證實(shí)，即將這些突變株導(dǎo)入感染的分子克隆中并測定這些克隆對(duì)藥物的易感性(Kellam?and?Larder,J?Virol69:669-74(1995))。這些數(shù)據(jù)顯示遺傳改變是產(chǎn)生多種抗藥性(MDR)的基礎(chǔ)。

HIV-l基因組是高度變化的，并且每個(gè)感染的個(gè)體包含大量在遺傳上相似但又不同的病毒變體(準(zhǔn)種)。當(dāng)治療患者體內(nèi)發(fā)生抗藥性時(shí)，己顯示至少某些病毒基因組不包含抗藥性突變。在含有抗性突變的病毒中，每個(gè)基因組中這些突變的數(shù)目是不同的。因此，抗藥性突變和治療效果之間的相互關(guān)系只能通過測定來自感染個(gè)體的大量的病毒群體中每個(gè)病毒基因組中的抗藥性突變的同一性、性質(zhì)和數(shù)目來充分了解。對(duì)于抗藥性機(jī)制的理解將推進(jìn)更有效地開發(fā)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物、更好的治療方案以及更準(zhǔn)確的療效預(yù)測。

目前，兩種方法可用于檢測抗藥性突變的存在并預(yù)測對(duì)于新的HAART方案產(chǎn)生抗性的可能性(Petropoulos等,Antimicrob?Agents?Chemother44:920-8(2000)，Van?Laethem等,J?Acquir?Immune?Defic?Syndr22:107-18(1999))。然而，這兩種測試方法對(duì)檢測較小的抗藥性病毒群體的靈敏度很低，并且不能可靠的檢測野生型病毒中抗藥性病毒所占的百分比。此外，由于抗藥性突變是基于病毒群體進(jìn)行檢測，因此這兩種測試方法都不適于連鎖分析，而該連鎖分析可以揭示對(duì)于理解抗藥性機(jī)制和預(yù)測治療效果所需的關(guān)鍵性信息。最近，開發(fā)了多種檢測較小的抗藥性群體的實(shí)時(shí)PCR方法(Charpentier等,J?Viro178:4234-47(2004)，Hance等,J?Virol75:6410-7(2001)，Metzner等,J?Infect?Dis188:1433-43(2003)，Metzner等,Aids19:1819-25(2005)，Mohey等,J?Clin?Virol34:257-67(2005)，Thelwell等,Nucleic?Acids?Res28:3752-61(2000)，Whitcombe等,Nat?Biotechnol17:804-7(1999))。但是這些測試方法每次僅能檢測一種抗藥性突變，這使得它們對(duì)于全部的抗藥性突變的分析的實(shí)用性較低。并且，對(duì)于HIV-1基因組中的高度遺傳變異性，很難設(shè)計(jì)能夠用來檢測大多數(shù)遺傳性變型的全部抗藥性突變。