技術領域??????

本發明屬于動物繁殖技術領域，特別涉及一種降低牛、羊精液中畸形精子比率和死精子比率的方法。

背景技術??????

哺乳動物精液畸形率較高時和活力較低時會導致其受胎率低下，例如：我國制定了“牛冷凍精液國家標準”，標準中明確規定新鮮精液精子活力≥65%，精子畸形率≤15%；冷凍精液解凍后精子活力≥35%，精子畸形率≤18%。目前人類精子廣泛采用密度梯度離心法、過濾柱法等去除低活力精子，應用于人工授精后取得一定效果，但存在以下問題：1、試劑盒價格昂貴，成本相對較高；2、反復離心操作可能會給精子造成物理損傷，精液冷凍后質量有所下降；3、試劑盒殘留物難以徹底去除，是否對受胎后續有影響尚需試驗證實。為了降低畸形精子比率、提高精子活力，進而提高其受胎率，研究開發了降低精液畸形率和死精率的方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種降低牛、羊精液中畸形精子比率和死精子比率的方法，是通過上游法，利用活精子具有較強游動能力的特點，與死精子、活力低的精子、未成熟的精子、畸形精子、白細胞等物質分離，降低牛、羊精液中畸形精子和死精子比率，從而提高精子活力，達到受精受胎的目的。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：一種降低牛、羊精液中畸形精子比率和死精子比率的方法，其特征在于：它包括如下步驟：

(一)、Staining??Talp稀釋液的配置：

NaHCO_{3?????????????????????????????????????????}10mmol/L，

????????Hepes?????????????????????40mmol/L，

MgCl_{2???????????????????????????????????????????}0.4mmol/L，

NaLactate?????????????????25mmol/L，

KCl???????????????????????3mmol/L，

Glucose???????????????????5mmol/L，

NaCl??????????????????????95mmol/L，

Na₂HPO_{4????????????????????????????????????????}0.3mmol/L，

NaPyruvate????????????????2mmol/L，

0.3%BSA???????????????????3g/L；

以上成分依次溶解入超純水中，最終體積定容至1L；

（二）、Staining??Talp稀釋液的保存：?????

????Staining??Talp稀釋液保存在4℃，保存期限為兩周；

（三）、上游法處理新鮮精液：

（1）提前37℃預熱容器，再將4ml?Staining??Talp稀釋液預熱至37℃后，置于容器內；

（2）選取活力區間為40%-60%的新鮮精液，取1ml注入容器內Staining??Talp稀釋液的底部，37℃溫浴30分鐘；

（3）吸出頂部4ml精液，將吸出的4ml精液3000rpm/min離心5分鐘，棄掉3?ml上清液，保留底部1ml精液；

?（四）、精液各項指標檢測：

（1）精子活力檢測：

預先把載玻片和蓋玻片放在37℃加熱板上預熱10分鐘，用移液器離心管從步驟（三）（3）的底部1ml精液中取15μl樣品，滴在準備好的載玻片上，壓片后置于顯微鏡下鏡檢，選擇壓片均勻的樣品區域觀察，一個壓片取5個視野，中間1個，四周各取1個，分別計數活精子數和死精子數，并計算活力；

精子活力=活精子數/活精子數與死精子數的和；

（2）畸形率檢測：

A、從步驟（三）（3）的底部1ml精液中取一滴精液滴于載玻片一端，用另一邊緣光滑的載玻片與有樣品的載玻片成35°夾角，將樣品均勻地涂抹于載玻片上，自然風干約5?min，每樣品制作2個抹片；

B、在已風干的抹片上滴上1.0?mL～2.0?mL0.05%福爾馬林，pH值為6.5-7.5，固定15?min后用清水緩緩沖去福爾馬林，吹干或自然風干；