技術(shù)領(lǐng)域

本專利屬于微藻培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域（C12N1/12），是一種微藻藻株人工選育方法。

背景技術(shù)

微藻為自養(yǎng)型微生物，因其細(xì)胞內(nèi)存在光合作用系統(tǒng)也稱為微藻植物。微藻具有高效吸收太陽能、固定二氧化碳產(chǎn)生生物質(zhì)的能力（即光合作用能力）；同時微藻作為微生物的一種，其增殖速度較快。作為單細(xì)胞生物，微藻的主要組成為蛋白、脂肪、碳水化合物和核酸等。目前，微藻已經(jīng)是重要的養(yǎng)殖餌料被養(yǎng)殖企業(yè)廣泛應(yīng)用，同時微藻也已經(jīng)成為類胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、多糖等保健食品的來源。隨著化石能源枯竭的預(yù)期加劇，微藻在能源制品和精細(xì)化學(xué)品的潛在應(yīng)用也得到了極大關(guān)注。

目前，實際生產(chǎn)應(yīng)用的藻種多從自然界直接分離獲得，后代的性狀單一，容易出現(xiàn)對環(huán)境的適應(yīng)能力差以及藻種退化等問題。以傳統(tǒng)的方法進行藻種的復(fù)壯或重新選育優(yōu)良藻株，往往需要較長的周期和花費大量的人力。為了獲得高產(chǎn)及滿足下游煉制需求的藻株，必須改進微藻的育種技術(shù)，從而對微藻的種質(zhì)進行改良。

常壓室溫等離子體（ARTP）是近幾年來發(fā)展起來的一種新的等離子體源，能夠在常壓(1am)下產(chǎn)生溫度在25～40℃之間的、具有高活性粒子（如處于激發(fā)態(tài)的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等）濃度的等離子體射流?？茖W(xué)研究表明，等離子體中適當(dāng)劑量的活性粒子作用于微生物，能夠使微生物細(xì)胞壁/膜的結(jié)構(gòu)及通透性改變，并引起基因損傷，進而使微生物基因序列及其代謝網(wǎng)絡(luò)顯著變化，最終導(dǎo)致微生物產(chǎn)生致畸突變。

常規(guī)微藻藻株篩選也是一個耗時較長的工作，因為大多檢測方法都是基于獲得一定生物量基礎(chǔ)上開展的。如，常規(guī)的微藻油脂評估至少需要數(shù)百毫升微藻藻液，從固體平板至所需要生物量平均需要一個月的培養(yǎng)時間。而同時，誘變篩選可能獲得上百個備選藻株，因此，適宜的誘變后篩選技術(shù)也是微藻藻株選育的重要一環(huán)。

隨著各種染色方法靈敏度的提高，利用染色法對微藻生物質(zhì)進行評估需要生物量大大少于常規(guī)方法，為提高篩選提供了可能，如，碘液可以對細(xì)胞內(nèi)的淀粉進行染色，以熒光染料尼羅紅可以對細(xì)胞內(nèi)的中性脂進行染色等。

因此，基于上述分析，本發(fā)明提出了一種新型微藻藻株人工選育方法，將等離子體誘變與基于染色的快速篩選相結(jié)合，具有高效、快速獲得目標(biāo)藻株的特點。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種微藻藻株人工選育方法。

野生藻株的馴化和改良是微藻工業(yè)化生產(chǎn)實現(xiàn)所必需的，為了提高微藻藻株選育的速度，本發(fā)明結(jié)合了綠色無污染的常壓室溫等離子體誘變、基于吸光度與特異性熒光染料熒光強度變化的藻株篩選技術(shù)，實現(xiàn)目標(biāo)藻株高效、快速獲得的目的。

本發(fā)明利用常壓室溫等離子體對野生藻株進行誘變，即使用室溫常壓等離子體儀對微藻培養(yǎng)液進行誘變。其中待誘變微藻細(xì)胞濃度在100-1000萬細(xì)胞/毫升，誘變微藻藻液在10～200μL，電源輸出功率為50～200W，工作氣流量為1～20SLM，等離子體發(fā)射源與樣品之間距離為1～10mm，放電時間5秒～2分鐘。

所述誘變操作結(jié)束后，將誘變處理后的微藻涂布于固體培養(yǎng)基上，在選擇壓力（溫度、光強、缺陷培養(yǎng)基）或正常培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，同時以未誘變處理的藻液作為對照。誘變成功的判定標(biāo)準(zhǔn)：對于正常培養(yǎng)條件下，至藻落生長出后，分別對誘變和對照組進行藻落計數(shù)，以致死率=（1-誘變藻落數(shù)/對照藻落數(shù)）×100%大于或等于90%為成功誘變的指標(biāo)，對生長出誘變藻落進行96孔板培養(yǎng)篩選；對于選擇壓力下，生長出的藻落即用于96孔板培養(yǎng)篩選。

所述藻落在96孔板中進行液體培養(yǎng)，利用酶標(biāo)儀或者具有孔板掃描功能的分光光度計對孔板培養(yǎng)的微藻OD值進行測定，獲得藻細(xì)胞生長情況。根據(jù)不同微藻藻株可選用不同的檢測波長，如金藻通常使用650～680nm檢測，綠藻通常使用750nm檢測。

所述液體培養(yǎng)微藻通過特異性染色劑進行染色，以顯色強弱對目標(biāo)代謝物生產(chǎn)情況進行檢測。通常利用碘液對細(xì)胞內(nèi)淀粉進行染色，以熒光染料尼羅紅或者BODIPY對細(xì)胞內(nèi)中性脂或者油脂進行染色。

最終，根據(jù)篩選目的，結(jié)合生長于代謝物生產(chǎn)情況，確定對應(yīng)的誘變藻株，用于后續(xù)研究或生產(chǎn)實踐。

本發(fā)明是在室溫、大氣壓、低電壓環(huán)境下使用等離子體對微藻進行誘變，避免了常規(guī)物理化學(xué)誘變方法的毒性或強細(xì)胞損傷，同時處理時間短，誘變處理過程僅有幾分鐘；利用96孔板培養(yǎng)作為篩選基礎(chǔ)，將OD檢測與特異性顯色反應(yīng)結(jié)合，避免了常規(guī)檢測過程中需要較長培養(yǎng)時間以獲得足量生物質(zhì)的弊端，同時可對大量藻株進行測定，從藻落到初步篩選出目標(biāo)藻株的時間縮短至一周左右。因此本發(fā)明相對常規(guī)微藻藻株選育是一種綠色、高效、快速的新方法。