[發明專利]基于轉錄組測序開發綠豆SSR引物的方法有效
| 申請號: | 201310629710.6 | 申請日: | 2013-11-29 |
| 公開(公告)號: | CN103642912A | 公開(公告)日: | 2014-03-19 |
| 發明(設計)人: | 陳紅霖;程須珍;王素華;王麗俠 | 申請(專利權)人: | 中國農業科學院作物科學研究所 |
| 主分類號: | C12Q1/68 | 分類號: | C12Q1/68;C12N15/11 |
| 代理公司: | 北京路浩知識產權代理有限公司 11002 | 代理人: | 王文君 |
| 地址: | 100081 北京市海*** | 國省代碼: | 北京;11 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 基于 轉錄 組測序 開發 綠豆 ssr 引物 方法 | ||
1.一種基于轉錄組測序開發綠豆SSR引物的方法,其特征在于,包括以下步驟:
1)構建轉錄組文庫:提取綠豆葉片總RNA,分離出mRNA,反轉錄并合成雙鏈cDNA,純化cDNA,在cDNA末端添加腺嘌呤核苷并連接測序接頭,然后通過瓊脂糖凝膠電泳回收200-700bp片段,對回收片段進行PCR擴增,即構建得到轉錄組文庫;
2)對上述轉錄組文庫進行測序,利用軟件Trinity將測序序列拼接成一個完整的轉錄組,取每條基因中最長的轉錄本作為Unigene,并對Unigene序列進行生物信息學分析;
3)采用軟件MISA1.0對上述Unigene進行SSR檢測;
4)采用軟件Primer3進行SSR引物設計,并鑒定SSR引物的多態性。
2.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟1)中所述測序接頭為:
5′RNA?Adapter:5′-GATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3′
3′RNA?Adapter:5′-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′。
3.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟2)中所述軟件Trinity的版本為v2012-10-05;參數設置:min_kmer_cov為2,其它參數為默認參數。
4.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟2)中所述生物信息學分析包括但不限于基因注釋、CDS預測和差異表達基因篩選。
5.根據權利要求4所述的方法,其特征在于,所述基因注釋包括基因表達量注釋和/或基因功能注釋。
6.根據權利要求4所述的方法,其特征在于,所述差異表達基因篩選包括GO功能顯著性富集分析和/或Pathway顯著性富集分析。
7.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟4)中用于鑒定SSR引物多態性的綠豆選自中國中綠1號、中綠5號;泰國VC2778A、TC1966;俄羅斯1810、1865;澳大利亞ACC814、ACC41中的至少一種。
8.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟4)中進行SSR引物設計使用的參數為:引物長度18-22bp,Tm55-65℃,產物大小100-300bp。
9.根據權利要求1-8任一項所述方法開發的綠豆SSR引物,其特征在于,所述SSR引物的序列如SEQ?ID?No.1-64所示。
10.權利要求9所述綠豆SSR引物在綠豆分子標記輔助育種中的應用。
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