技術領域

本發明涉及一種BES-SSR標記引物及其用于作物品種鑒定的方法，具體涉及水仙BES-SSR標記引物AG9及鑒定水仙品種的方法，屬于分子生物學領域。

背景技術

水仙為石蒜科水仙屬?(Narcissus?L.)?多年生球根花卉，大多數原產于地中海沿岸及歐洲中部地區，約有40個原生種和許多變種，據英國皇家園藝學會統計，現約有1萬多個園藝品種，其花色、花姿十分豐富，且部分水仙具宜人的香味，已成為世界各國廣泛栽培的著名觀賞兼藥用花卉。然而，水仙具有夏季休眠特性，每年開花一次，從花型花色方面鑒定周期較長，耗時耗力，其鱗莖和葉型也十分相似，很難從生物學性狀上將其有效地區分開來，對水仙的品種選育及鑒定方面都有著嚴重的影響。

陳林姣等?(2002年)，朱震霞?(2003年)，Tucci?等?(2004年)，Lu?Gang等?(2007)，鄭琴芳等?(2012年)?利用第一代分子標記技術RAPD、ISSR、AFLP對中國水仙及水仙的遺傳多樣性及親緣關系進行了不同程度的分析；Hodgins等?(2007年)?以歐洲野生黃花水仙為材料，利用富集文庫篩選法得到8個微衛星標記，其操作較為復雜且費用較為昂貴；袁菊紅?(2011年)?利用得到的10對SSR標記引物對中國石蒜屬遺傳多樣性和親緣關系進行了分析，其實驗材料中涉及中國水仙且擴增出了帶型。現有的基于水仙屬的分子標記數量了了可見，遠遠不能滿足水仙屬分子生物學的研究，這將嚴重制約了水仙種質資源遺傳多樣性分析的準確性和遺傳圖譜構建的精確性。可見，開發新的分子標記鑒定技術，對水仙種質資源遺傳多樣性進行分析研究，為水仙新品種選育上提供有效的技術支持，在水仙育種及種質鑒定方面有著十分重要的意義。

但是，現有的第一代分子標記如：擴增的限制性內切酶片段長度多態性標記?(amplified?fragment?length?polymorphism,?AFLP)，第一步需要制備高分子量基因組DNA，然后酶切找到特異片段，實驗程序繁瑣，操作復雜；限制性內切酶片段長度多態性標記?(restriction?fragment?length?polymorphism,?RFLP)，技術難度大，操作復雜，所需DNA質量高，要經過Southern雜交且需選用單拷貝探針，標記數量少且多態性較低；隨機擴增多態性DNA標記?(randomly?amplified?polymorphic?DNA,?RAPD)和簡單序列重復標記?(inter-simple?sequence?repeat,?ISSR)二者均為顯性，不能區分是純合還是雜合個體，且RAPD重復性較低，對DNA模板的質量要求很高，而水仙屬植物葉片和鱗莖中含有大量的多糖多酚類物質，這將對DNA提取增加了難度，所以此法不適用于水仙標記分析。

簡單重復序列?(simple?sequence?repeat,?SSR)?或稱為微衛星DNA?(microsatellite?DNA)，又稱為短串聯重復?(short?tandem?repeats,?STR)?是指一類由幾個?(多為1-6個)?堿基組成的基序?(motif)?串聯而成的DNA序列，為第二代普遍認可的新型分子標記技術，其隨機廣泛分布于各類真核生物基因組的不同位置，大約每隔10-50kb的DNA序列中就會出現一個SSR位點。SSR標記具有高度的多態性且分布于整個基因組中，用于檢測簡單易操作，實驗重復性高，所需模版DNA量少，僅需微量組織或者干組織樣品，便于數據比較分析，SSR遵循孟德爾共顯性遺傳模式，能夠區別純合顯性個體和雜合顯性個體等諸多有點。目前SSR標記技術已成為構成遺傳連鎖圖譜、研究群體遺傳學、進行分子標記輔助育種、系譜分析、品種指紋圖譜繪制、品種純度檢測、目標性狀分子標記篩選和法醫鑒定的理想工具，已經廣泛應用于擬南芥、大豆、棉花、花生、葡萄、小麥、水稻、番茄、甜菜和油菜等多種植物上。

目前，開發的SSR標記主要有G-SSR?(基因組SSR)?和EST-SSR?(表達序列標簽SSR)?兩種，而現有的水仙EST數據庫中登錄的水仙EST序列還很少，開發SSR標記遠遠不夠，且利用EST序列開發獲得的SSR標記多態性較基因組SSR標記低，因此利用水仙基因組中獲取SSR位點信息，開發基于水仙基因組的SSR標記引物對水仙種質鑒定和遺傳多樣性分析等領域提供有效的標記技術，迫在眉睫。

發明內容