技術領域

本發明是利用抗病基因同源序列方法，克隆絲瓜抗褐斑病基因片段或者將其轉化為分子標記等，主要涉及絲瓜常規雜交育種，分子標記輔助育種，抗褐斑病基因的定位和分子作圖，抗褐斑病基因的克隆以及抗病基因的調控機理分析等方面，屬于植物生物技術科學領域。

背景技術

褐斑病是絲瓜生產上最重要的病害之一。主要為害葉片。病斑褐色至灰褐色，圓形或長形至不規則形，直徑0.5～13毫米。病斑邊緣明顯或不明顯，有時現出褪綠至黃色暈圈，霉少見。早晨日出或晚上日落時，病斑上可見銀灰色光澤，即病原體反射所致。褐斑病嚴重影響了絲瓜植株的正常的生長發育過程，給生產帶來極大的經濟損失。抗病基因的利用及抗病育種是絲瓜病害防治最有效的方法。

二十世紀四十年代，Flor提出了經典的“基因對基因”理論學說，即植物和病原菌體內各自存在一個顯性基因，植物抗病基因或病菌無毒性(Avr)基因的缺失或改變都能引起病害的產生。這個模型適用于大多數活體營養型病原菌，包括病毒、細菌、真菌和線蟲類。“基因對基因”抗病性一般是受體被作為模型：植物抗病蛋白能夠直接或間接的識別源自病菌的Avr產物。一旦這種識別發生，就會引起防御反應。大多數抗病基因(Resistance?gene；R)觸發的抗性與快速防御反應相關，稱為過敏性反應(hypersensitive?response；HR)。而目前，大多數抗病基因的產物都含有蛋白識別的結構域，如富含亮氨酸的重復單位(LRR)的結構域或卷曲螺旋(CC)的結構域；信號轉導結構域，如核苷酸結合部位(NBS)或蛋白激酶(PK)結構域。一些抗病基因產物被預測為細胞質蛋白，而另一些通過一個跨膜結構域(TM)貫穿細胞膜。這些結構域組合能夠產生不同類型的R蛋白。根據結構的特性已經鑒定出至少六種不同類型的R基因：1)NBS-LRR，2)LRR-TM-PK，3)LRR-TM，4)CC-TM，5)PK，6)PK-PK。其中，NBS-LRR類抗病基因是植物體內存在的最大一類抗病基因；這些抗病基因在結構上的保守性為我們利用抗病基因同源序列法克隆其他作物的抗病基因帶來了潛在可能。在已知分離獲得的抗病基因中，小麥抗葉銹病基因Lr10和馬鈴薯抗馬鈴薯X病毒基因Rx2就是利用抗病基因同源序列法克隆抗病基因的經典例子，說明利用該法克隆抗病基因是可行的。

發明內容

技術問題

本發明的目的是利用抗病基因同源序列法快速鑒定絲瓜褐斑病基因片段或者將其轉化為分子標記及。結果一方面可用于絲瓜抗褐斑病分子標記輔助選擇育種，另一方面也為抗褐斑病基因的克隆提供參考依據。

技術方案

本發明前期對大量絲瓜種質資源進行抗病性篩選，在獲得高抗絲瓜褐斑病抗病種質的基礎上，應用抗病基因同源序列法克隆抗褐斑病基因片段，通過與已知抗病基因同源性及序列比對分析等方法確認；為開發相應的分子標記和利用cDNA末端快速擴增技術獲得抗病基因的全長奠定基礎。

為了實現上述目標，本發明采用抗病基因同源序列法對絲瓜抗褐斑病基因進行克隆，獲得了抗褐斑病基因片段或者基因標記3個，片段大小分別為498bp、501bp和497bp。以該基因片段序列為基礎，開發相應的分子標記，可以進行絲瓜抗褐斑病分子標記輔助選擇育種；同時利用基因片段或者基因標記進行新的種質資源的創新；結合已有的分子標記可以實現絲瓜抗褐斑病基因的分子作圖；利用這些基因片段，通過設計基因特異引物，采用cDNA末端快速擴增技術分離絲瓜抗褐斑病基因，為通過基因工程改良絲瓜的抗病性奠定基礎；也為最終解析絲瓜抗褐斑病基因的分子機理提供了基因資源。

本發明的積極效果：

1)有利于快速開發與抗病基因緊密連鎖的分子標記。通過鑒定的絲瓜褐斑病基因，開發相應的共分離功能性標記(SNP、SCAR等)，可以快速的用于抗病基因的分子標記輔助選擇，準確性高。

2)縮短了絲瓜抗褐斑病基因的挖掘周期，有利于褐斑病基因的快速鑒定。采用常規方法(圖位克隆、轉座子標簽等)挖掘抗白粉病基因不僅耗時耗力、效率低，且難以成功。本發明基于抗病基因同源序列方法快速挖掘絲瓜抗褐斑病基因，不僅可以縮短時間，還可以提高褐斑病基因鑒定效率。

3)有利于多抗性育種材料的創制。基于新鑒定的褐斑病基因開發的功能性分子標記，結合已經定位的其他抗病基因的分子標記，進行多抗性育種材料的創制，可以縮短育種年限，提高育種效率。