技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其是一種牛雙芽巴貝斯焦蟲病PCR快速診斷試劑盒。

背景技術(shù)

雙芽巴貝斯焦蟲（Babesia??bigemina）病是對牛危害較大的一種血液寄生蟲病。蟲體經(jīng)微小牛蜱、鐮形煽頭蜱和二棘血蜱等中間宿主傳播給牛體，當(dāng)蜱叮咬牛時，蟲體隨蜱的唾液進(jìn)入牛體，隨即由血液進(jìn)入紅細(xì)胞，在紅細(xì)胞內(nèi)以“成對出芽”方式進(jìn)行繁殖。牛感染上雙芽巴貝斯焦蟲病，其臨床癥狀表現(xiàn)為稽留熱（體溫升高至40～41.5℃），病畜精神沉郁，食欲不振，腹瀉或便秘，消瘦、貧血，黏膜蒼白、黃膽，后期通常出現(xiàn)血紅蛋白尿，急性病例在4～8天內(nèi)死亡。

牛雙芽巴貝斯焦蟲病的流行歷史悠久，極大地威脅著養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。凡是引進(jìn)純種牛、雜交牛和本地牛混合飼養(yǎng)放牧的場所，極容易發(fā)生和流行此病，如不及時治療其發(fā)病死亡率則占發(fā)病數(shù)50%～100%，這將給養(yǎng)牛生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的損失。目前，隨著人們對乳牛制品的需求日益增長，草山草坡資源的綜合開發(fā)和利用，人工草地飼養(yǎng)與發(fā)展奶牛、改良牛群數(shù)量日漸增加，該病的發(fā)生和流行日趨增加，對于確診該病，有效地控制和預(yù)防該病的發(fā)生和流行顯得尤為重要。傳統(tǒng)的診斷方法是根據(jù)臨床癥狀和血涂片光學(xué)顯微鏡檢查確診，但由于該蟲在顯微鏡下難于與附紅體、牛巴貝斯蟲、泰勒焦蟲等血液原蟲區(qū)分，這為準(zhǔn)確判斷該病造成了影響；有許多血清學(xué)方法可檢測該病原，如：補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)，間接免疫熒光抗體試驗(yàn)，間接血凝試驗(yàn)等，但存在一定的假陽性和假陰性，現(xiàn)在市場缺少一種能對牛雙芽巴貝斯焦蟲病臨床樣本進(jìn)行簡便、快捷、靈敏、準(zhǔn)確的檢測試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是：提供一種牛雙芽巴貝斯焦蟲病PCR快速診斷試劑盒，它可以從全血臨床樣本中直接檢測到牛雙芽巴貝斯焦蟲病原核酸，靈敏度約為41.29pg，具有簡便、快捷、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：牛雙芽巴貝斯焦蟲病PCR快速診斷試劑盒，它包12mL紅細(xì)胞裂解液，6mL?TBS液，1.2mL蛋白酶K，5.4mL裂解液，300μL?PCR酶，300μL?DL2000?Marker，60μL引物，60μL陽性對照，330μL陰性對照，6mL?TE緩沖液，30個吸附柱；引物包括上引物及下引物，上引物及下引物的體積均為30μL，濃度均為20μM；上引物的序列為：5’-CCCCTATCACCTTCAACC?-3’，下引物序列為：??5’-ACTGCGAGCACTCAATCC?-3’。

紅細(xì)胞裂解液組成包括1.5M?NH₄CL，100mM?KHCO₃及10mM?Na₄EDTA，用1N?HCL或1N?NaOH調(diào)pH至7.2-7.4。

TBS液包括10mmoL/L的Tris含0.9%NaCL，用1N?HCL調(diào)pH至7.4。

蛋白酶K用TE溶液配制成20mg/mL。

裂解液包括10mM的?Tris-HCL、1mM的?EDTA、2.5M?的NaCL以及占裂解液總體積5%的SDS組成的混合溶液。

TE緩沖液包括：10mM的Tris-HCL及1mM的EDTA組成的混合溶液，混合溶液的PH值為7.8。

PCR酶的組成包括：10mM的Tris-HCL（PH8.3）、50mM的KCL、1.5mM的MgCL_2?以及0.05U?Polymerase/μL?。

陰性對照為超純水；?陽性對照為牛雙芽巴貝斯焦蟲DNA模板。

為了驗(yàn)證本發(fā)明的技術(shù)效果，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)：

牛雙芽巴貝斯焦蟲病PCR快速診斷試劑盒的研制

材料與方法

1、參考蟲株：牛雙芽巴貝斯焦蟲標(biāo)準(zhǔn)蟲株DNA模板，由中國科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所寄生蟲病室惠贈。附紅體、環(huán)形泰勒焦蟲、巴貝斯焦蟲DNA模板，均由本所重大疫病檢測室采集到的病料所提模板而得。

2、主要試劑

2.1?引物（濃度為20μM，用TE溶液配制）

根據(jù)牛雙芽巴貝斯焦蟲熱休克蛋白基因片段設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增出一長度為318bp大小的特異片段,該序列在Genbank上的登錄號為AF332567.1。引物序列如下：

上引物：5’-CCC?CTA?TCA?CCT?TCA?ACC?-3’

下引物：5’-ACT?GCG?AGC?ACT?CAA?TCC?-3’?

由上海捷瑞生物工程有限公司合成。