所屬技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地，涉及一種ABCB1基因多態性焦磷酸測序方法及試劑盒。

背景技術

ABCB1轉運蛋白家族是一類跨膜蛋白，其主要功能是利用ATP水解產生的能量將與其結合的底物等主動轉出質膜，ABCB1基因在人類多藥耐藥基因族中起主導作用，其表達受各種因素的影響，屬于可調控基因。研究顯示與ABCB1的基因表達、蛋白結合能力影響較大的3個單核苷酸多態性分別為：rs1128503，rs2032582和rs1045642。ABCB1定位于人類7號染色體q21.1，由28個外顯子組成，編碼一個170kDa的跨膜糖蛋白-P糖蛋白。它是人體內重要的轉運蛋白之一，在胃腸道、肝臟、腎臟、腦等重要組織器官廣泛分布，參與多種藥物的吸收、分布及分泌和排泄。

ABCB1是一種能量依賴性藥物輸出泵，當化療藥物靠濃度梯度到達細胞后與ABCB1蛋白結合，導致ATP結合區活化，此時其核苷酸結合位點與ATP結合，ATP隨即水解為ADP釋放能量，在Mg2+作用下使P糖蛋白形態發生變化，在藥物尚未發生細胞毒作用之前被轉移至細胞外，使細胞內藥物濃度降低，于是作用到藥物靶位細胞核位置的藥物濃度相對降低而產生多藥耐藥。rs2032582是位于ABCB1外顯子上第893位密碼子上G到T／A突變，導致893位丙氨酸突變為絲氨酸或蘇氨酸，生化分析證實這種突變會影響藥物轉運。GG野生型細胞內的鉑類藥物濃度高于突變型，導致細胞死亡和嚴重的中心粒細胞毒性。在美國前列腺癌人群中被發現該位點和rs1045642的多倍型與多西紫杉醇治療的中性粒細胞毒性的顯著相關。

氯吡格雷是一種新型噻吩吡啶類的抗血小板藥物，氯吡格雷為藥物前體，本身無活性，氯吡格雷約50％經胃腸道吸收后在肝臟內迅速代謝，血漿中原形藥物濃度極低。氯吡格雷在小腸的吸收受到ABCB1基因編碼的質子泵P糖蛋白調控。研究表明ABCB1基因rs1128503，rs2032582和rs1045642三者存在連鎖不平衡關系含有兩個ABCB1C3435T等位基因變異體可降低氯吡格雷的血藥濃度。在對白種人中研究時發現攜帶3435TT突變型純合子基因型個體的P糖蛋白的表達量比正常野生型個體低51％。FAST-MI研究顯示攜帶兩個ABCB1C3435T等位基因的患者比沒有攜帶的主要終點事件(死亡，非致命性卒中、心肌梗死等)的風險高。在接受氯吡格雷治療的患者中，ABCB13435C→T基因型與心血管死亡、心肌梗死及卒中等事件風險呈顯著相關(P=0.0064)，與ABCB1基因型3435CT／CC攜帶者相比，純合子TT攜帶者主要終點事件風險增加72％；在健康人群中，純合子3435TT攜帶者應用氯吡格雷后血小板最大聚集率出現絕對降低，但降幅較CT／CC攜帶者減小7.3％(P=0.0127)。ABCB1基因型3435TT攜帶者降低了對血小板的抑制，且在氯吡格雷治療期間復發性缺血事件的風險有所增加。

焦磷酸測序技術(Pyrosequencing)作為一種新的序列分析技術，相對傳統的Sanger測序法，焦磷酸測序更快、更簡單，且便宜得多。焦磷酸測序方法由4種酶催化同一反應體系中的酶級聯化學發光反應，在每一輪測序反應中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就能將其加入到引物鏈中并釋放出等摩爾數的焦磷酸(PPi)。PPi可最終轉化為可見光信號，并由Pyrogram?TM轉化為一個峰值，其高度與核苷酸數目成正比。其操作簡單，結果準確可靠，可以行大規模分析。

基于以上所述，本發明采用焦磷酸測序對ABCB1基因的三個多態性位點進行檢測，對進行化療的腫瘤患者或接受氯吡格雷治療的患者提供個性化治療方案提供決策依據。

發明內容

本發明的目的在于，提供一組用于檢測ABCB1基因多態性位點rs1128503的核苷酸序列。

本發明的目的在于，提供一種用于檢測ABCB1基因多態性位點rs2032582的核苷酸序列。

本發明的目的在于，提供一種用于檢測ABCB1基因多態性位點rs1045642的核苷酸序列。

本發明的目的在于，提供一種用于檢測ABCB1基因多態性位點rs1128503、rs2032582和rs104564的焦磷酸測序方法及試劑盒。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

一組用于檢測ABCB1基因多態性位點rs1128503、rs2032582和rs1045642的焦磷酸測序方法中使用的PCR引物及測序引物，其特征在于，其組成為：