技術領域

本發明基因工程酶技術領域，具體涉及狒狒尿酸氧化酶基因及牛乳鐵蛋白肽基因的克隆表達方法，本發明還涉及該兩種蛋白組成的融合蛋白的分離純化方法。?

背景技術

尿酸氧化酶是生物體內嘌呤代謝途徑中的一個酶，以氧作為受體,能夠催化尿酸氧化生成尿囊素和過氧化氫(Richette等Lancet2010,318-328)。尿酸氧化酶在生物界廣泛存在。從古細菌、細菌、真菌、酵母、放線菌、植物、魚類、兩棲動物和大多數非靈長目哺乳動物及少數靈長目動物體內均能找到尿酸氧化酶。但是在人類和高等靈長目動物，由于尿酸氧化酶基因在進化過程中發生無義突變，致使這些物種，如猿類體內沒有尿酸氧化酶存在(Wu等,PNAS1989,9412-9416)。由于缺少尿酸氧化酶，嘌呤代謝產生的尿酸不能被進一步氧化而最終以尿酸的形式通過腎臟排出體外，導致人體內尿酸的濃度明顯比其他動物高。高濃度的尿酸存會給人體帶來許多嚴重的疾病，如高尿酸血癥，痛風，腫瘤溶解綜合癥等。?

尿酸氧化酶被發現和應用于醫療始于1974年(Fam等,Current?rheumatology?reports2005,29-35)。當時使用的是從黃曲霉中提取得到的尿酸氧化酶。之后各種來源的尿酸氧化酶陸續被發現并被用于研究。但是由于純度不高，難于控制，在使用中產生各種各樣的副作用。八十年代，隨著基因工程技術的興起，重組表達尿酸氧化酶逐漸成為獲取尿酸氧化酶的主要途徑。現今已有多個物種的重組尿酸氧化酶表達成功。Suzuki等(Suzuki等,Plant?Physiology1990,384-389)于1990年成功地將大豆尿酸氧化酶基因克隆到大腸桿菌表達。1996年，Candida?utilis尿酸氧化酶在大腸桿菌中成功表達(Koyama等,J.Biochem.1996,969-973)。Legoux等(Legoux等,JBC1992,8565-8570)通過將黃曲霉尿酸氧化酶基因克隆到大腸桿菌中,發現尿酸氧化酶在細胞內以可溶性表達形式存在。Ishikawa等(Hongoh等，Insect?Biochemistry?and?Molecular?Biology2000,173-182)成功地將Nilaparvata?lugens尿酸氧化酶基因克隆在大腸桿菌中表達，但是表達量并未提供。?

重組尿酸氧化酶在臨床上的應用則始于1995年，Rozenberg等首次利用重組尿酸氧化酶用于心臟移植病人的痛風石治療(Rozenberg等,Rev.Rhum.Engl.Ed.,1995,62(5),392-394),證明了重組尿酸氧化酶在醫療上的巨大前景。2001年，由Sanofi-Synthélabo公司研發的重組黃曲霉尿酸氧化酶注射劑在歐洲成功上市，并于2003年獲準在美國上市，用于高尿酸血癥的預防和治療（腫瘤化療高尿酸血癥的治療和預防）。?

乳鐵蛋白肽(lactoferrcin,Lfcin)是乳鐵蛋白在酸性環境下經胃蛋白酶水解，從N端釋放的一段多肽。分子內富含色氨酸。有關研究發現，Lfcin除了不能結合鐵離子外，具備乳鐵?蛋白的所有生物學活性，如抗菌、抗病毒、抑制癌細胞生長、消炎及參與免疫反應等。由于Lfcin具有普通抗生素所不具有的一系列優點，包括廣譜抗菌能力和不易產生耐藥性的特點、能抑制病毒、真菌增殖和抑殺腫瘤細胞、對真核生物細胞幾乎沒有毒性，再加上Lfcin不含稀有氨基酸和外源化學成分，是一種健康安全的產品，顯示了Lfcin替代抗生素的巨大潛能。因此，關于Lfcin的結構、功能、作用機制及基因工程已成為近年來研究的熱點^[25]。?

不同來源的乳鐵蛋白在動物消化道中都能釋放出Lfcin。不同種類的Lfcin氨基酸長度有所不同，但其序列具有高度同源性，總體來說均包含17-42這段小肽。?

牛乳鐵蛋白肽(bovine?lactoferrcin,LfcinB)是牛乳鐵蛋白在胃蛋白酶水解作用下釋放出的一種含25個氨基酸殘基的短肽。其分子結構如圖1-5所示。其中LfcinB_20-25是LfcinB的活性中心。由于分子內富含大量的堿性氨基酸，其pI值大于12。在pH7時，其分子凈電荷數大于7，因而具有較強的陽離子特征，水溶性好，在水溶液中呈現反平行β-折疊結構。LfcinB分子中的第6位和第8位色氨酸對其殺菌活性至關重要。此外，由于分子中有兩個半胱氨酸形成二硫鍵，LfcinB具有抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的能力。?

不同動物的Lfcin，例如在人源、鼠源、牛源和羊源的乳鐵蛋白肽中，牛乳鐵蛋白肽活性是最高的，這也是人們將研究重點移至LfcinB的原因。?