[發明專利]含SARS病毒N抗原的重組蛋白及展示N蛋白的桿狀病毒有效
| 申請號: | 201310301846.4 | 申請日: | 2013-07-18 |
| 公開(公告)號: | CN104292338B | 公開(公告)日: | 2017-02-15 |
| 發明(設計)人: | 張耀洲;閆晶晶;舒特俊;陳劍清;蓋其靜 | 申請(專利權)人: | 特菲(天津)生物醫藥科技有限公司 |
| 主分類號: | C07K19/00 | 分類號: | C07K19/00;C12N15/62;C12N15/866;C12N15/66;A61K48/00;A61P31/14 |
| 代理公司: | 北京匯澤知識產權代理有限公司11228 | 代理人: | 張秋越 |
| 地址: | 300457 天津市濱海新區經*** | 國省代碼: | 天津;12 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | sars 病毒 抗原 重組 蛋白 展示 桿狀病毒 | ||
1.一種含SARS病毒N抗原的重組蛋白SP-N-TM,其特征在于,該蛋白是由SARS病毒的N蛋白的N-端連接桿狀病毒囊膜蛋白GP64的信號肽SP,C-端連接桿狀病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM構成。
2.根據權利要求1所述的含SARS病毒N抗原的重組蛋白SP-N-TM,其特征在于,氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。
3.權利要求2所述的含SARS病毒N抗原的重組蛋白SP-N-TM的編碼基因,其特征在于,核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。
4.一種表面展示SARS抗原N蛋白的重組桿狀病毒,其特征在于,該病毒是由權利要求3所述重組蛋白SP-N-TM的編碼基因插入到供體質粒并通過轉座與穿梭載體Bacmid的基因組進行同源重組,獲得重組桿狀病毒基因組DNA,然后將重組桿狀病毒基因組DNA轉染家蠶細胞,在家蠶細胞內包裝得到所述的表面展示SARS抗原N蛋白的重組桿狀病毒。
5.根據權利要求4所述的表面展示SARS抗原N蛋白的重組桿狀病毒,其特征在于,所述供體質粒為pFastBacDual,重組蛋白SP-N-TM的編碼基因插入到供體質粒pFastBacDual的p10啟動子下,構建成重組轉座質粒后再與穿梭載體Bacmid的基因組進行同源重組。
6.根據權利要求5所述的表面展示SARS抗原N蛋白的重組桿狀病毒,其特征在于,所述家蠶細胞為家蠶BmN細胞。
7.權利要求4~6任一所述的表面展示SARS抗原N蛋白的重組桿狀病毒的制備方法,其特征在于,步驟如下:
(1)PCR擴增獲得桿狀病毒囊膜蛋白GP64信號肽SP的編碼基因、SARS病毒的N蛋白的編碼基因和桿狀病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的編碼基因;
(2)通過重疊PCR擴增的方法拼接步驟(1)獲得的三種基因序列,得到重組蛋白SP-N-TM的編碼基因,再將編碼基因片段連接到載體pFastBacDual的p10啟動子下,構建成重組轉座質粒;
(3)重組轉座質粒轉化含桿狀病毒穿梭載體Bacmid的大腸桿菌DH10Bac感受態細胞,進行同源重組,在含有卡那霉素、慶大霉素、四環素、X-gal和IPTG的LB培養平板上進行藍白斑篩選,避光培養40~48h后挑取白斑,白斑繼續培養24~48h后抽提重組桿狀病毒基因組DNA進行PCR鑒定;
(4)取步驟(3)鑒定正確的重組桿狀病毒基因組DNA通過脂質體介導法轉染家蠶細胞,發病后獲得一代病毒懸液,提取病毒基因組再次進行PCR鑒定,鑒定正確的即為表面展示SARS抗原N蛋白的重組桿狀病毒;
所述PCR鑒定使用如SEQ?ID?NO:3、SEQ?ID?NO:4和SEQ?ID?NO:9所示的引物序列。
8.根據權利要求7所述的表面展示SARS抗原N蛋白的重組桿狀病毒的制備方法,其特征在于,步驟(1)中擴增桿狀病毒囊膜蛋白GP64信號肽SP的編碼基因使用的引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO:4~5所示;擴增SARS病毒N蛋白的編碼基因使用的引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO:6~7所示;擴增桿狀病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的編碼基因使用的引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO:8~9所示。
9.權利要求4~6任一所述的表面展示SARS抗原N蛋白的重組桿狀病毒在制備SARS疫苗中的應用。
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