技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及樹(shù)突狀細(xì)胞，尤其是涉及一種有效遞呈胃癌抗原的樹(shù)突狀細(xì)胞的制備方法。

背景技術(shù)

樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic?cells,DC）是目前已知體內(nèi)抗原遞呈能力最強(qiáng)、唯一能活化初始型T淋巴細(xì)胞的抗原遞呈細(xì)胞。DC以主要組織相容性復(fù)合物（major?histocompatibility?complex,MHC）-多肽復(fù)合物的形式遞呈抗原，在天然免疫和獲得性免疫中發(fā)揮著極其重要的作用，引起當(dāng)前腫瘤免疫治療的密切關(guān)注。

大量的研究表明，DC與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切，腫瘤的發(fā)生可能與腫瘤浸潤(rùn)性DC或宿主DC功能缺陷有關(guān)，在此情況下，腫瘤患者體內(nèi)的DC處于一種“無(wú)能狀態(tài)”，無(wú)法有效地遞呈腫瘤抗原，激活T細(xì)胞識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞。可能的原因是由于腫瘤分泌產(chǎn)生的可溶性免疫抑制因子和某些細(xì)胞因子抑制了DC的免疫監(jiān)視和應(yīng)答功能，從而發(fā)生免疫逃逸。此外，DC在活化過(guò)程中本身存在的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制也影響了DC免疫功能的發(fā)揮。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子（Suppressor?of?cytokine?signaling，SOCS）家族成員SOCS1在DC的免疫負(fù)反饋調(diào)節(jié)中起著重要作用。采用基因敲除或siRNA技術(shù)阻斷或抑制SOCS1的表達(dá)和功能發(fā)揮能明顯增強(qiáng)DC的抗原遞呈功能和更好地誘發(fā)特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。值得一提的是，SOCS1拮抗劑，即pJAK2(1001–1013)多肽（1.Waiboci?LW,Ahmed?CM,Mujtaba?MG,Flowers?LO,Martin?JP,Haider?MI,Johnson?HM.Both?the?suppressor?of?cytokine?signaling1(SOCS-1)kinase?inhibitory?region?and?SOCS-1mimetic?bind?to?JAK2autophosphorylation?site:implications?for?the?development?of?a?SOCS-1antagonist.J?Immunol.2007,178:5058-5068），能增強(qiáng)免疫細(xì)胞的抗病毒能力和T細(xì)胞的免疫殺傷作用，間接證明了pJAK2(1001–1013)多肽能有效抑制SOCS1的負(fù)調(diào)節(jié)效應(yīng)（2.Ahmed?CM,Dabelic?R,Martin?JP,Jager?LD,Haider?SM,Johnson?HM.Enhancement?of?antiviral?immunity?by?small?molecule?antagonist?of?suppressor?of?cytokine?signaling.J?Immunol.2010,185:1103-1113），故pJAK2(1001–1013)多肽有望在扭轉(zhuǎn)DC功能缺陷或改善DC抗原遞呈功能上發(fā)揮重要作用。目前，采用pJAK2(1001–1013)多肽修飾而獲得有效遞呈抗原的樹(shù)突狀細(xì)胞及其制備方法尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種有效遞呈胃癌抗原的樹(shù)突狀細(xì)胞的制備方法，該方法可改善樹(shù)突狀細(xì)胞抗原遞呈功能和特異性免疫應(yīng)答水平，采用SOCS1拮抗劑，即pJAK2(1001–1013)多肽，修飾胃癌細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染的樹(shù)突狀細(xì)胞。

本發(fā)明包括如下步驟：

1）胃癌細(xì)胞MGC-803總RNA的提取、鑒定：采用試劑從胃癌細(xì)胞MGC-803中提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度、瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA分子量大小；

2）SOCS1拮抗劑pJAK2(1001－1013)多肽的合成；

3）外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的分離；

4）單核細(xì)胞（Monocyte）的獲取：采用“人CD14⁺單核細(xì)胞分離試劑盒”從步驟3）分離得到的PBMC中分選出單核細(xì)胞；

5）未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞（iDC）的體外誘導(dǎo)：將步驟4）獲取的單核細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)基中經(jīng)細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)后即產(chǎn)生未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞（iDC）；

6）RNA轉(zhuǎn)染未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞；

7）pJAK2(1001－1013)多肽負(fù)載RNA轉(zhuǎn)染的樹(shù)突狀細(xì)胞：pJAK2(1001–1013)多肽與經(jīng)RNA電穿孔轉(zhuǎn)染的iDC孵育4h進(jìn)行負(fù)載；

8）未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞（iDC）的成熟誘導(dǎo)：將步驟6）和7）經(jīng)RNA轉(zhuǎn)染和SOCS1拮抗劑pJAK2(1001-1013)多肽負(fù)載后的iDC采用LPS和TNF-α誘導(dǎo)后，即可產(chǎn)生成熟樹(shù)突狀細(xì)胞（mDC）。