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[發明專利]降鈣素原抗體的制備方法有效

專利信息
申請號: 201310216386.5 申請日: 2013-06-04
公開(公告)號: CN103275223A 公開(公告)日: 2013-09-04
發明(設計)人: 吳玉水;黃慶生;謝玉玲;車速 申請(專利權)人: 福建省洪誠生物藥業有限公司
主分類號: C07K16/26 分類號: C07K16/26;C07K14/585;C12N15/81;C12N15/16
代理公司: 暫無信息 代理人: 暫無信息
地址: 351254 福建*** 國省代碼: 福建;35
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摘要:
搜索關鍵詞: 降鈣素 抗體 制備 方法
【權利要求書】:

1.一種降鈣素原抗體的制備方法,其特征在于,該方法包括:

構建降鈣素原重組質粒;

以所述降鈣素原重組質粒為表達載體,通過酵母真核表達制備降鈣素原;以及

利用所述表達的降鈣素原蛋白制備降鈣素原抗體。

2.如權利要求1所述的降鈣素原抗體的制備方法,其特征在于,構建降鈣素原重組質粒的步驟包括:

利用引物序列制備降鈣素原基因目的片段;

以所述降鈣素原基因目的片段為模板進行聚合酶鏈反應擴增;以及

基于所述降鈣素原基因擴增產物構建所述降鈣素原重組質粒。

3.如權利要求2所述的降鈣素原抗體的制備方法,其特征在于,利用引物序列制備降鈣素原基因目的片段的步驟包括:

引物F1序列和引物R1序列經變性、退化和延伸獲得第一DNA片段;

所述第一DNA片段和引物R2序列進行退火延伸獲得第二DNA片段;以及

所述第二DNA片段和引物R3序列進行退火延伸獲得降鈣素原基因目的片段;

其中,變性處理的溫度為94℃,時間為60秒;退火處理的溫度為50℃,時間為60秒;延伸處理的溫度為72℃,時間為90秒;引物F1序列含Xho?I酶切位點,引物R3含Spe?I酶切位點。

4.如權利要求3所述的降鈣素原抗體的制備方法,其特征在于,所述引物序列包括:

F1:5’atctcgagaaaagagcaccattcaggtctgccctggagagcagcccagcagacccggcc3’;

R1:5’ccagtgcagccagcaggaggcgcgcttcgtcctcactgagcgtggccgggtctgctgg3’;

R2:5’tcctgctccagctcactggccttcatctgcacatagtcctgcaccagtgcagccagca3’;

R3:5’atactagtccgcttagatctggggctgtccaggctggagccctctctctcttgc3’。

5.如權利要求2所述的降鈣素原抗體的制備方法,其特征在于,以所述降鈣素原基因目的片段為模板進行聚合酶鏈反應擴增的步驟包括:

制備聚合酶鏈反應的反應物,所述反應物包括5μL降鈣素原基因目的片段、12.5μL的2×EcoTaq緩沖液、5.5μL無菌水、引物F1液和引物R3液各1μL,所述引物液分別含對應引物15pmol;

進行聚合酶鏈反應擴增,反應條件為在94℃下變性5分鐘,然后進行以下擴增循環:在94℃下變性30秒,在50℃下退火30秒,在72℃下延伸50秒,反應進行30個循環后,在72℃下延伸5min;以及

對所述擴增產物進行純化。

6.如權利要求2所述的降鈣素原抗體的制備方法,其特征在于,基于所述降鈣素原基因擴增產物構建所述降鈣素原重組質粒的步驟包括:

分別對所述降鈣素原基因擴增產物和質粒載體進行雙酶切處理;

分別對酶切后的質粒載體和降鈣素原基因擴增產物進行純化;

將純化后的質粒載體和降鈣素原基因擴增產物進行體外連接;

將所述連接產物體外轉化克隆進大腸桿菌,獲得降鈣素原重組質粒;

其中,酶切處理的溫度為37℃,時間為1小時;降鈣素原基因擴增產物酶切體系包括1μL限制性內切酶Xho?I,1μL限制性內切酶Spe?I,5μL緩沖液,15μL降鈣素原基因擴增產物,和28μL無菌水;質粒載體酶切體系包括1μL限制性內切酶Xho?I,1μL限制性內切酶Spe?I,5μL緩沖液,15μL質粒載體,和28μL無菌水;

連接處理的溫度為14℃,時間為過夜;連接體系為:1μLT4連接酶,3μL無菌水,2μL緩沖液,10μL酶切并純化后的降鈣素原基因擴增產物,和5μL酶切并純化后的質粒載體。

7.如權利要求6所述的降鈣素原抗體的制備方法,其特征在于:所述大腸桿菌為DH5a菌株,所述質粒載體為pPIC9K-ALB質粒載體。

8.如權利要求5或6所述的降鈣素原抗體的制備方法,其特征在于:采用1%的瓊脂糖凝膠電泳回收進行純化。

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