技術領域

本發明屬于RT-PCR檢測試劑盒技術領域，尤其涉及一種H7N9禽流感病毒三重RT-PCR檢測試劑盒，以及鑒定H7亞型禽流感病毒、N9亞型禽流感病毒、通用檢測所有亞型禽流感病毒的引物對或引物對組及其試劑盒。

背景技術

禽流感病毒（Avian?Influenza?Virus，AIV）屬于正粘病毒科A型流感病毒屬，為單股負鏈RNA，多形態的有囊膜病毒。禽流感病毒的基因組分為8個節段，分別編碼HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1和PB2蛋白，病毒囊膜上的纖突，分別具有血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）的活性。這兩個基因是病毒的特異性抗原，根據HA和NA蛋白抗原性不同，目前可分為16個H亞型（H1-H16）和9個N亞型（N1-N9）。

由于禽流感病毒其基因組呈節段復制，通過依賴RNA聚合酶完成復制，而RNA聚合酶缺乏校正功能，所以禽流感病毒發生基因突變的頻率極高。自2013年2月以來，華東地區上海市、安徽省、江蘇省、浙江省先后發生不明原因重癥肺炎病例，于3月31日將其確診為人感染H7N9禽流感病毒。這是首次發現H7N9禽流感病毒感染人的病例，目前，急需建立H7N9禽流感病毒的快速檢測方法和研發相應試劑。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種敏感性好、特異性高、快速方便的H7N9禽流感病毒三重RT-PCR檢測試劑盒，以及鑒定H7亞型禽流感病毒、N9亞型禽流感病毒、通用檢測所有亞型禽流感病毒的引物對或引物對組及其試劑盒。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：H7N9禽流感病毒三重RT-PCR檢測試劑盒，包括由三對特異性引物構成的引物對組；三對特異性引物分別是鑒定H7亞型禽流感病毒HA基因的引物對AIV?H7-1和AIV?H7-2（簡稱引物對1），鑒定N9亞型禽流感病毒NA基因的引物對AIV?N9-1和AIV?N9-2（簡稱引物對2），鑒定所有亞型禽流感病毒M基因的引物對AIV?M-1和AIV?M-2（簡稱引物對3）；引物對AIV?H7-1和AIV?H7-2、引物對AIV?N9-1和AIV?N9-2、引物對AIV?M-1和AIV?M-2的特異性引物分別具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的堿基序列。

上述H7N9禽流感病毒三重RT-PCR檢測試劑盒，包括反轉錄RT反應液、PCR反應液、DEPC水、超純水；反轉錄RT反應液每管16μL，含有5×Reverse?Transcriptase?Buffer?10μL、50pmol9mer?Random?Primer2μL、10mM?dNTP?Mixture2μL、40U?Ribonuclease?Inhibitor1μL和5U/μL?AMV?Reverse?Transcriptase1μL；PCR反應液每管28.2μL，含有2×EasyTaq^TM?PCR?SuperMix25μL、25μM?AIV?H7-1和AIV?H7-2引物各0.8μL、25μM?AIV?N9-1和AIV?N9-2引物各0.4μL、25μM?AIV?M-1和AIV?M-2引物各0.4μL；DEPC水和超純水各1mL。在實際應用中，引物對組中的引物對1至3在PCR反應體系中的摩爾比為2：1：1，各引物對中的兩條引物均等摩爾。PCR反應體系中，引物對1中兩條引物的終濃度均為0.4μM，引物對2中兩條引物的終濃度均為0.2μM，引物對3中兩條引物的終濃度均為0.2μM。待測樣品來自健康的動物或死亡的動物（可為RNA）；對待測樣品進行PCR擴增的退火溫度為50-60℃，51℃較佳。

鑒定H7N9禽流感病毒的引物對組，由兩對特異性引物構成；兩對特異性引物分別是鑒定H7亞型禽流感病毒HA基因的引物對AIV?H7-1和AIV?H7-2，鑒定N9亞型禽流感病毒NA基因的引物對AIV?N9-1和AIV?N9-2；引物對AIV?H7-1和AIV?H7-2、引物對AIV?N9-1和AIV?N9-2的特異性引物分別具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的堿基序列。

鑒定禽流感病毒的引物對，包括特異性引物AIV?M-1和AIV?M-2，它們分別具有序列表SEQ.ID.No.5至SEQ.ID.No.6的堿基序列，可通用檢測所有亞型禽流感病毒。

鑒定H7亞型禽流感病毒的引物對，包括特異性引物AIV?H7-1和AIV?H7-2，它們分別具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.2的堿基序列。